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《医麦客：2024细胞与基因治疗国内法规汇编（336页）.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医麦客：2024细胞与基因治疗国内法规汇编（336页）.pdf（336页珍藏版）》请在本站上搜索。 1、02目录一、CGT 领域1、体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）20220531.042、细胞和基因治疗产品临床相关沟通交流技术指导原则 20231229.26二、基因治疗药理毒理（非临床研究）1、基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）20211203.41临床研究1、基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）20211203.522、基因治疗血友病临床试验设计技术指导原则 20230414.61药学 CMC1、人用基因治疗制品总论（公示稿）20190610.672、体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）20220531.793、重组腺相关病毒载体类体2、内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则.20240119.106三、细胞治疗（含干细胞）药理毒理（非临床研究）1、干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）20150731.1152、基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）20211203.1263、人源干细胞产品非临床研究技术指导原则 20240118.133临床研究1、细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点 20180313.144032、免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）20210210.1473、嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）治疗产品申报上市临床风险管理计划技术指导原则.2023、20129.1614、人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）20230621.1685、间充质干细胞防治移植物抗宿主病临床试验技术指导原则（试行）20240118.181药学 CMC1、基因转导与修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）202009.1902、细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）20171222.2123、CAR-T.细胞治疗产品质量控制检测研究非临床研究考虑要点 20180605.2294、.体细胞治疗临床研究和转化应用管理办法（试行）（征求意见稿）20190329.2615、药品生产质量管理规范-细胞治疗产品附录（征求意见稿）20220124.4、2696、免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）20220531.2817、人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）20230427.3038、自体 CAR-T 细胞治疗产品药学变更研究的问题与解答 20231116.32304体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）国家药品监督管理局药品审评中心2022 年 05 月05一、前 言近年来，细胞治疗和基因编辑等技术手段蓬勃发展，相关临床医疗探索不断深入，为严重和难治性疾病提供了新的治疗理念和方法。日益增加的临床需求促进了基因操作新技术的应用和更新。在人体外，采用基因工程技术构建的修饰系统,可有效地将遗传物质等转入特5、定目的细胞，用于修饰目的细胞的遗传物质、改变基因表达方式或调节细胞生物特性等。目前，慢病毒载体、-逆转录病毒载体等常见用于将嵌合抗原受体（Chimeric.Antigen.Receptor,.CAR）基因导入.T.细胞，以实现.CAR-T.细胞对肿瘤的靶向杀伤；游离型载体（Episomal.Vector）、仙台病毒载体等可用于将转录因子导入细胞，通过重编程获得诱导多能干细胞，为其衍生细胞产品的生产提供起始原材料。将来，预计会有更多样的载体设计适用于不同类型的产品。基因修饰系统种类多样，载体设计、制备过程以及质量控制等方面的差异直接影响到最终产品的安全性和有效性，且其来源可能不同，质量管理体系存6、在差异。为保证基因修饰系统质量符合临床应用的要求，需对其进行充分的质量研究。因此，有必要细化不同类型基因修饰系统药学研究的技术要求。本指导原则基于当前的科学认知，针对体外用基因修饰系统提出申报上市阶段的建议性技术要求，旨在为研发单位提供指导意见，同时，也作为监管机构评价的重要参考。本指导原则不具有强制性，若有可替代或适用的其他研究方法，或本指导原则中有不适用的内容，申请人/持有人可提供相应说明及相关替代研究的支持理由和依据。随着技术的发展、认知的深入和经验的积累，针对本指导原则内容后续将逐步修订和完善。二、适用范围本指导原则中，基因修饰系统指在人体外，将外源基因等导入细胞，通过添加、替代、补偿7、、阻断、修正特定基因从而为获得细胞治疗产品或细胞治疗产品生产用种子细胞而使用的修饰系统。可能的作用机制包括细胞内表达功能性目的基因，或采用基因敲除、修复、插入等核苷酸编辑方式改变特定的基因序列等。目前，基因修饰系统包括慢病毒、-逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、仙台病毒等病毒载体，以及.DNA、RNA、蛋白质和蛋白质-RNA.复合物等非病毒基因修饰系统。本指导原则对病毒载体类和非病毒载体类两类基因修饰系统进行论述。随着本领域技术的不断更迭，新的基因修饰系统也可能应用，如适用，其药学研究也可参考本指导原则。06三、一般原则基因修饰系统的设计合理性、工艺稳定性、质量可控性可直接影响细胞终产品的安全性8、和有效性，是药学研究的重点。需要开展的药学研究，可能包括上游设计、制备工艺、质量研究与控制、稳定性研究等多个方面。基因修饰系统的制备全过程原则上应符合药品生产质量管理规范（GMP）的要求，具体的要求根据其使用情形的不同可具体问题具体分析。基因修饰系统的质量风险虽与体内基因治疗产品有相似之处，但又有别于体内基因治疗产品。体外基因修饰后的细胞还可能经过体外培养、换液清洗步骤，在应用于人体之前还要经过细胞终产品放行检测。因此，基因修饰系统相较于体内基因治疗产品，其修饰特性可能在回输前得到控制，一些相关的杂质残留可以经过质量控制后进行放行，需要结合其特点开展体外基因修饰系统的设计和质量研究与控制。（一9、）不同研发阶段的一般要求同其他药物的研发一样，基因修饰系统的药学研究也具有阶段性、渐进性等特征，随细胞终产品非临床和不同临床试验阶段研究的推进而变化。研发者应提前制定研究计划和策略，鼓励按照“质量源于设计”的理念进行相关研究，随着研发深入，逐步优化制备工艺，加强质量控制。临床试验申报阶段，需识别和控制基因修饰系统的相关风险，明确其分子设计，完成生产用种子（如适用）的建库和检定，初步评估选用生产用原材料的合理性和安全性，通过工艺研究建立相对稳定的制备工艺，开展相应的质量研究，建立适当的质量标准，以确保基因修饰系统及其所修饰细胞临床应用的安全性。基因修饰系统应用于申报上市阶段的细胞产品时，随着对工10、艺和质量属性认识的加深，工艺不断优化，经过充分的工艺开发及验证研究确定基因修饰系统的商业化工艺。如果在临床试验期间，基因修饰系统的工艺发生变更，需完成基因修饰系统和相应细胞产品的可比性研究；建议在确证性临床试验前，完成重大变更，并确定工艺。基于充分深入的质量研究和多批次数据积累，制定合理的质量控制策略，明确关键质量属性（Critical.Quality.Atribute，CQA），确定适宜的分析方法，进行全面的方法学验证；同时，应关注修饰系统相关或工艺相关的杂质研究，并制定相应的风险控制策略。规范开展并完成稳定性研究和包材相容性研究，制定合理的贮存条件和时间。（二）不同来源基因修饰系统的一般要11、求07基因修饰系统可能存在自行生产、委托生产、购买等多种来源，不同来源基因修饰系统遵循相同的技术要求和质量控制原则，药学研究均可参考本指导原则开展。细胞终产品的上市许可持有人应对基因修饰系统的质量负主体责任，通过加强内部质量控制或对基因修饰系统生产方的审核、制定质量协议等控制相应的质量风险。如果基因修饰系统发生变更，应及时评估风险，开展相应的药学可比性研究，在某些情况下可能还需要非临床或/和临床桥接研究。四、风险评估与控制（一）整体风险识别与控制策略基因修饰系统涉及的风险主要包括病毒载体回复突变、载体在基因组中整合致癌或致病、脱靶风险、外源因子污染、杂质残留等。药学研究可从修饰系统的设计、制备12、工艺和质量控制等多个方面开展风险因素的分析，识别、确定与产品质量和安全性相关的风险因素,确定研发期间所需进行风险评估的数据范围和重点，并制定风险防控和处理措施。同时，需结合细胞类型、剂量、给药途径、使用人群、作用机制、体内分布、体内作用时间等方面综合考虑风险。基因修饰系统设计方面，典型风险因素可能包括：风险元件的使用，同源序列可能导致的序列重组，病毒载体经相应野生型或辅助病毒互补后产生回复突变,载体在细胞中潜伏/再激活和/或动员，载体在细胞染色体整合程度和整合点的偏好性等。制备工艺方面，相关风险因素可能包括：高风险原材料的使用，制备过程中外源因子的污染，中间产物的贮存和质量控制，有害杂质的引入13、与生成，以及修饰系统的基因序列稳定性等。质量控制方面，相关风险因素可能包括：检测方法的适用性、标准限度的合理性等。近年来，基于酶的基因编辑系统逐渐应用于细胞治疗产品的基因修饰，常见的系统包括转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription.activator-like.effector.nucleases，TALEN）、规 律 性 重 复 短 回 文 序 列 簇-相 关 蛋 白（Clustered.regularly.interspaced.short.palindromic.repeats-CRISPR.associated.protein，Cas）等。该类系统的临床使用风险主要包括基14、因工具酶的自身毒性、免疫原性、基因编辑时基因上靶、脱靶导致的毒性和杂质残留等。因此，应根据多方面因素，结合细胞终产品的特点，针对不同类型基因修饰系统的特性进行风险评估和控制。例如，根据风险评估情况，合理设计修饰系统的结构和序列，避免使用致癌元件等高风险的元件，进行相关检测，尽可能降低同源重组和病毒载体回复突变的可能性；对高风险的生产原材料进行质量控制，在适当的制备环节，设定过程控制的检测项目和验收标准；根据修饰系统作用机理，针对基因序列稳定性等安全性相关的风险08因素开展研究等。在细胞终产品生命周期内对修饰系统进行跟踪分析和更新，收集数据以进一步确定其风险特征并制定控制策略。（二）不同生产使用15、情形的风险基因修饰系统在细胞治疗产品生产过程中的使用情形可能不同，目前研究可能包括体外基因修饰后直接制备细胞产品（情形一）和体外基因修饰后建系/库再制备细胞产品（情形二）两种使用情形。两种使用情形相应基因修饰系统的风险不同，其药学研究的要求可能存在差异，需要具体问题具体分析。对于情形一，基因修饰系统建议在.GMP.的条件下制备，该情形下所用的基因修饰系统与回输人体的细胞直接接触，应关注该系统生产用原材料的质量控制、批次间的质量差异、杂质水平等可能影响细胞治疗产品安全性、有效性的研究内容。本指导原则后文主要论述该情形。对于情形二，基因修饰系统用于细胞系/库的建立，其序列的设计、生产用材料、制备工16、艺、质量、稳定性、内包材的要求可依具体情况，结合细胞系/库的质量研究结果进行综合评估。由于基因修饰系统使用情况的复杂性（如一次使用或多次使用），可结合生产使用情况和细胞系/库的研究和检测情况，制定修饰系统的风险控制策略。良好的基因修饰系统质量研究与控制有利于筛选、建立出质量良好的细胞系/库，有利于后续的生产研究。细胞系/库建立过程中，建议进行单克隆筛选，对细胞系/库进行检定和传代稳定性研究，关注细胞系/库功能是否符合理论设计和预期、安全是否可控，必要时对细胞终产品进行基因修饰相应的质量研究，以确认基因修饰系统的适用性。（三）变更风险随着基因修饰技术不断更新和研究经验的逐步积累，研发过程常常伴随17、基因修饰系统的升级和工艺的优化，因此研发各阶段基因修饰系统有可能发生变更。基因修饰系统变更可能显著影响细胞产品的安全性和有效性，是细胞治疗产品药学研究的重要风险之一，研发者需评估变更引入的影响和风险。根据风险评估情况，对基因修饰系统及其细胞终产品（如适用）的质量、工艺控制、稳定性等方面进行深入研究，合理设计变更可比性研究方案。五、基因修饰系统的设计、制备和质量控制09（一）病毒载体类基因修饰系统1.病毒载体的设计与构建1.1 目的基因及调控元件目的基因是基因修饰系统中实现预期功能的关键序列，调控元件是影响目的基因序列转录、翻译和稳定性的重要序列。研发者应基于细胞终产品的安全性和有效性，结合风险18、评估，进行基因修饰系统各元件的设计与构建。目的基因：目的基因：本文中是指基因修饰系统传递、表达的遗传物质，研发者应结合其在疾病治疗中的作用或作用机理谨慎选用和设计目的基因序列，关注目的基因的来源、序列筛选及优化过程，明确完整的核苷酸、氨基酸（如适用）序列信息，并建议与数据库收录的相关序列进行序列比对。目的基因的优化中，应阐述分子改构的科学评估及验证研究考虑，如人源化改构，敲减元件，自杀标记，以及为调控高级结构形成或为适应载体大小进行的序列改造和删减等。同时，建议结合目的基因或其表达产物与靶分子的特异性结合能力，评估潜在的非特异性效应等。可以结合目的基因序列特征、目的蛋白与细胞基因组的相互作用等19、，充分考虑目的基因对目的细胞基因组稳定性的影响。如目的基因属于非人源或改构的序列等，也可结合种属间目的基因序列差异和表达产物的免疫特性，评估目的基因的免疫原性。调控元件：调控元件：功能性元件对目的基因的转录和表达具有重要调控作用，研发者应关注其设计原理并进行确认研究。可以根据目的基因的表达量、预期作用和持续时间以及目的细胞的类型等合理选择和设计调控元件，相关的调控元件可能包括信号肽、转录启动子、增强子、终止子、隔离子、5非翻译区、3非翻译区、多聚腺苷酸信号区、内含子、其他增强转录及翻译效率相关元件、复制起始位点、额外引入的基因序列等。各调控元件的序列来源及选择依据应明确。例如启动子设计方面，建20、议结合目标细胞类型、目的基因表达时间和表达量的需求、启动子的人用经验等分析其启动子使用的安全性，在风险评估的基础上合理选用。调控元件设计时需充分考虑元件的安全性和有效性，关注相关序列引入的必要性和合理性，尽量避免使用高风险的元件，如必需使用，应进行相关序列的安全性改构。对于序列改构或优化的元件，均应明确序列更改的依据与安全性考虑。此外，还建议关注功能元件设计对细胞基因组内源性基因的干扰。1.2 病毒载体病毒载体通常可以稳定、高效地转导目的基因至目的细胞中发挥作用。病毒载体的选择和设计可综合考虑目的基因表达时间、表达量，病毒载体的致病性、整合能力、感染过程、转导效率、细胞毒性以及细胞产品的细胞类21、型、作用机制、临床适应症、给药方法等多方面。10病毒载体的结构优化策略包括提高病毒稳定性、增强细胞转导率、拓宽可转导细胞类型等。目前常用的病毒载体通常进行了毒力、致病性或复制能力相关基因的删除，以确保使用的安全性。设计中，应尽可能降低与野生型病毒相关的任何致病性，并尽可能将病毒重组和回复突变的风险降到最低。对于改构的病毒载体需关注亲本病毒的来源、培养历史和生物学特性等，对改构用材料、方法、步骤及鉴定进行充分研究。病毒载体进行改构时，不应引入新的安全风险。下面以目前研究中常见的病毒载体为例进行说明。1.2.1.-逆转录病毒载体（-Retroviral.Vector）-逆转录病毒可逆转录其.RNA22、.基因组成为.DNA.拷贝，病毒.DNA.随机整合进入有丝分裂活跃的细胞基因组。目前，体外基因修饰用.-逆转录病毒载体常见有鼠白血病病毒（Murine.Leukaemia.Viruses，MuLV），猫白血病病毒（Feline.Leukaemia.Virus，FeLV）和长臂猿白血病病毒（Gibbon.Ape.Leukaemia.Virus，GALV）等载体。其基因设计与改造主要包括提高载体安全性和基因转导有效性。-逆转录病毒载体可通过转移质粒（含有目的基因）、辅助质粒瞬转细胞进行病毒载体包装，也可通过整合了转移质粒序列、辅助包装元件的稳定产毒细胞系制备。为提升基因修饰载体的安全性，建议对修饰23、系统进行优化，例如使用删除了非必需元件、经充分改构、安全性级别较高的.-逆转录病毒载体，尽可能将病毒重组和回复突变的风险降到最低。具体优化操作还可能包括使用异源启动子和异源.polyA.信号表达辅助包装元件、将辅助包装元件拆分于不同质粒表达、改造长末端重复序列（Long.terminal.repeat，LTR）使得末端自失活（Self.Inactivating,.SIN）等方式。基因转导有效性方面，鼓励研发者对病毒载体包装元件进行优化，提高病毒载体包装效率、结构稳定性和转导活性等，如将.-逆转录病毒载体的包膜蛋白替换为其他包膜蛋白以提高病毒稳定性等。针对改造情况，需进行充分的研究与验证。1.224、.2 慢病毒载体（Lentiviral Vector）慢病毒载体通过介导目的基因整合至细胞基因组发挥作用，与.-逆转录病毒载体只能感染有丝分裂活跃的细胞不同，慢病毒载体能感染有丝分裂活跃和不活跃的细胞。目前，体外基因修饰用慢病毒载体常见有人慢病毒、非人灵长类和非灵长类慢病毒等载体。使用非人灵长类和非灵长类慢病毒载体时建议关注产生重组病毒嵌合体和/或跨物种传播的相关风险。慢病毒载体的设计与改造主要包括提高载体安全性和基因转导有效性。慢病毒载体制备和临床使用的主要风险点包括：产生复制型慢病毒（Replication-competent.lentivirus，RCL），发生体内重组，以及在相关基因中25、或其附近插入前病毒.DNA.从而可能引起或促进肿瘤发生和其他细胞病变等。因此，慢病毒载体设计方面，建议采用11所有可能降低慢病毒致病风险的措施，包括不同包装基因分离于不同质粒表达（如.gag/pol和.rev.分离），降低辅助质粒和转移质粒间的序列同源性，删除不必要的调控元件，改造.LTR.使得末端自失活等。对于转移质粒，鼓励进行序列优化，提高安全性，如降低启动子插入目的细胞引起原癌基因活化的几率等。为了提高基因转导有效性，可考虑采用替换包膜蛋白、提升定点整合能力等改造策略。例如，人类免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒载体，可通过用编码异源病毒包膜蛋白（如.VSV-G）的基因替换.HIV.包膜26、蛋白基因序列来制备以增强载体的亲嗜性和稳定性。通过对整合酶和.LTR.等序列进行改造，提升慢病毒载体的定点整合性能。对载体改造的同时，建议关注病毒载体稳定性的变化、整合位点的偏好性等可能引入的风险。1.2.3 仙台病毒载体（Sendai Viral Vector）仙台病毒载体是在细胞质表达目的基因，通常不整合于细胞基因组中的单链反义.RNA.病毒载体。目前有研究将其应用于细胞重编程建立诱导多能干细胞系（iPSC）的过程中。设计和构建时，在稳定表达目的基因的同时，为防止产生具有复制能力的病毒颗粒，可考虑删除或改构病毒组装相关蛋白，例如参与病毒组装的核衣壳结构蛋白以及基质蛋白等。为确保有效地控制.27、iPSC.中仙台病毒载体的残留量，可以考虑改构复制相关元件，例如通过.RNA.聚合酶的突变等方式，构建具有温度依赖型复制能力的仙台病毒载体；同时，需建立相关方法检测和验证仙台病毒载体在.iPSC.克隆中是否残留以控制风险。其他病毒载体还可能包括腺病毒、腺相关病毒等载体，其分子设计和构建可以结合特定病毒结构、目的基因序列特征、包装序列的安全性等综合考虑。基本原则可参考上述内容。2.生产用物料2.1 质粒对于采用多个质粒瞬时共转染方式制备的病毒载体，需根据风险、结合载体特性等，开展相应的质粒设计构建、生产工艺、质量控制和稳定性等研究。设计和构建：设计和构建：根据研究，选择合理的质粒骨架、质粒复制起28、始点、启动子以及选择性标记等组成元件，删除非必需元件（特别是致癌等风险较高的序列），并完整确认质粒的核苷酸序列。质粒构建时一般应避免使用.-内酰胺类抗生素抗性基因，且质粒设计时建议最大程度防止抗性基因序列插入病毒载体基因组中，鼓励开发研究采用非抗性基因筛选的质粒。采用额外的增强转录或翻译的元件时，应充分评估其功能性和安全性，在必要时，进行相应的安全性改造，如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（Woodchuck.hepatitis.virus.posttranscriptional.regulatory.element,.WPRE）等。建议尽可能将不同包装元件拆分于多个质粒进行表达，以降低同源重组发29、生的概率。12生产工艺：生产工艺：根据工艺研究情况，通过对关键工艺参数的探索和优化，确定稳定的质粒规模化生产工艺，生产工艺应有明确的生产规模、工艺流程、工艺步骤的详细描述以及过程控制策略等。质粒生产过程中应尽量避免使用人源和动物源性材料，避免使用.-内酰胺类抗生素，如需使用其他种类的抗生素，应对抗生素的残留量进行控制和安全性评估。基于研发阶段和风险评估，开展质粒工艺验证或确认研究，如工艺过程控制确认、中间产物贮存稳定性研究、多批次质量分析以及杂质清除研究等。放行的质控项目一般包括：放行的质控项目一般包括：pH.值、外观、鉴别（限制性内切.酶.分析和.测序.）、质粒.浓度./.含量、纯度.与杂.30、质（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌.DNA.残留、宿主菌.RNA残留、宿主蛋白残留、抗生素残留（如适用）、无菌及细菌内毒素等。稳定性研究：稳定性研究：选择合理、敏感的考察项目（如超螺旋比例等）进行稳定性监测，根据研究结果制定合理的贮存条件和有效期。2.2 细菌种子批本指导原则细菌种子批指通过将病毒包装质粒转化宿主菌，经单克隆筛选及培养传代后建立的种子库。对于选用的宿主菌，需充分考虑宿主菌的来源、基因型、表型、既往使用经验和生产需求等因素，如使用新型菌株，需关注其可能引入的额外风险。细菌种子批的建立：细菌种子批的建立：根据研究建立各级细菌种子批，明确制备规模、扩增条件、贮存条件等。研究中31、关注目标克隆筛选的情况，关注用于生成种子批的材料的来源、生产过程等以评估分析安全性风险。细菌种子批的质量控制：细菌种子批的质量控制：建立适宜的放行检测项目、标准和检测方法。检测项目一般包括细菌形态学鉴别、染色镜检、生化特性分析、抗性检查、质粒限制酶切图谱分析、目的基因和其他元件序列准确性分析等。检测方法需经过研究确认和/或验证。通过质量控制应确保不存在其它细菌、真菌和噬菌体的污染，以及确保目的基因序列和其他元件序列的准确性。细菌种子批稳定性研究：细菌种子批稳定性研究：传代稳定性一般包括质粒大小、质粒序列准确性、质粒限制酶切图谱、质粒保有率、质粒拷贝数等，根据研究结果明确种子批的限定传代代次。贮32、存稳定性建议关注在贮存条件下和时长内种子批的活率等。2.3 生产/包装细胞库病毒载体制备涉及的细胞基质包括包装病毒载体用细胞基质和可以稳定产生病毒载体的细胞基质。选择细胞基质时，需要考虑病毒载体包装和制备的可行性，结合细胞来源（包括物种来源）、生长特性和载体制备能力，以及可能影响最终产品安全性的细胞特征等，选择适合的细胞基质。风险评估时，要充分考虑细胞基质中是否存在内源性病毒颗粒、致13癌序列等。对于新建立的细胞基质或具有相应风险的细胞基质（如肿瘤细胞来源的细胞），适用的情况下应评估细胞的成瘤性和致瘤性。有些情况下，需要对细胞基质进行修饰（例如插入特定病毒蛋白表达序列允许病毒复制或包装），研究33、中应该关注修饰后细胞的遗传、表观和生长等特性以及病毒载体制备情况等。细胞基质选定和/或修饰后需建立细胞库，以确保生产的稳定性和一致性。可参照中国药典、ICH.Q5A、ICH.Q5D.等相关要求对细胞库进行检定。检测项目需根据风险评估确定，至少包括鉴别、无菌、支原体、螺原体（昆虫细胞）以及内、外源病毒因子、种属特异性病毒等。开展细胞库传代稳定性研究，包括细胞生长稳定性、遗传稳定性、病毒载体包装能力稳定性等，建议研究中纳入病毒载体的生产终末细胞或平行生产的对照细胞，拟定适合病毒载体制备的细胞限传代次。合成病毒载体基因序列、表达载体蛋白，并最终形成病毒载体颗粒。例如，目前慢病毒载体包装常见使用.HE34、K293T 细胞，转入该细胞的质粒.LTR.之间的.DNA.片段被转录成RNA，由辅助质粒表达的蛋白将其包装形成病毒载体颗粒。需要关注的是，当病毒载体与非载体.DNA.序列（如质粒 DNA、辅助病毒序列、细胞.DNA.等）共同包装时，非载体DNA.序列可能与病毒载体同源重组，或其残留可能产生致癌风险，建议开展风险分析与研究，评估细胞基质选用的合理性。例如使用含有腺病毒.E1、SV40LT.抗原等风险元件的细胞基质包装慢病毒载体时，应关注载体中腺病毒.E1.和 SV40LT.抗原序列的残留量。可以稳定产生病毒载体的细胞库：细胞基质经基因修饰、筛选、建库后可稳定表达或产病毒包装用蛋白或元件，完成病35、毒包装和制备。例如，-逆转录病毒载体制备常见使用小鼠.PG13、HEK293-Phoenix.细胞等，生产用细胞需稳定表达.gag-pol、包膜蛋白、目的基因等。构建过程中建议关注其病毒包装效率和所产病毒载体的质量，并降低内、外源因子污染和复制型病毒产生等安全性风险。稳定产毒细胞系需经过基因修饰并通过单克隆筛选获得，获得的单克隆细胞系需建立细胞库，并进行全面的检定。同时，开展细胞传代稳定性研究，关注不同代次稳定产毒细胞中插入基因片段的遗传稳定性以及病毒载体的产量和质量等。2.4 病毒种子批通过病毒种子制备病毒载体或者辅助病毒的，需建立病毒种子批。病毒种子的来源、历史培养情况等需清晰明确，且风险36、可控。对于培养历史不清晰，存在其他病毒污染风险，或毒株单克隆性无法确认的病毒种子，不建议使用，如确需使用，可以在构建过程中进行多轮噬斑纯化、有限稀释纯化或通过.DNA/RNA.克隆拯救等，以确保毒株的纯度和单克隆性。种子批的建立过程、代次、贮存和维护等信息应清晰、明确；如有，应说明种子批制备过程使用的人源/动物源材料，并进行安全性评估。14病毒种子批应经过充分检测，检测项目建议包括：无菌、支原体以及外源病毒因子、病毒载体和目的基因的鉴别与测序、病毒滴度或浓度、生物学活性、杂质、对抗病毒药物的敏感性（如适用）、回复突变（如适用）等。建议对病毒种子批进行全基因测序，并对测序结果与预期序列进行对比分37、析，如有，需对所有差异进行评估。对于序列较长的病毒载体，建议最大程度进行序列分析，所分析的序列建议包括基因插入片段、侧翼区域以及载体中被修饰或可能易于重组的区域。病毒种子批需开展全面的传代稳定性研究，研究过程应能代表或模拟实际制备工艺，研究中关注病毒种子批的遗传稳定性和生产稳定性等。根据研究，制定病毒种子批的限定传代代次。如病毒载体制备过程使用了辅助病毒，应开展充分的研究说明辅助病毒使用的必要性和选择依据，结合科学认知及生产经验说明辅助病毒的安全性。辅助病毒的设计构建、建库、生产制备和检定建议参考上述病毒种子批的一般要求。2.5 其他生产用物料其他生产用物料包括原材料（如试剂、培养基等）、耗材38、、培养容器等。结合工艺研究，选用适宜的生产用原材料，制定合理的原材料质量控制标准，进行严格的供应商审计，明确生产用原材料的来源、组分、功能、使用阶段、质量标准等。制备过程中尽量避免使用人或动物来源的成分，如果确需使用，可参考中国药典相关规定和/或.ICH.Q5A.等指南开展外源因子等安全性相关的风险评估与研究。需要重点关注的原材料包括：用于细胞培养的人或动物源材料（如牛血清、消化酶），质粒转染试剂（如聚乙烯亚胺、阳离子脂质等），核酸酶等。对于病毒载体制备或贮存时使用的人血白蛋白等风险较高的制品，建议尽可能选用经监管部门批准，并符合国家相关技术要求和管理规范的产品。对于耗材和培养容器，建议经过分39、析和研究，评估其适用性，尽量降低病毒载体制备过程中的安全性风险。3.制备工艺病毒载体的制备工艺是指从生产用细胞的复苏扩增、病毒载体的收获到病毒载体灌装、贮存（如有）的全过程。对于体外基因修饰后直接制备细胞产品的病毒载体系统，由于病毒载体质量可直接影响终产品质量，因此其制备工艺研究应更加充分完善。在对整体工艺的充分理解和对病毒载体质量的累积经验基础上制定制备工艺，建立规范的工艺操作步骤、工艺控制参数和废弃标准，并明确关键工艺参数。制备工艺应适用于确保细胞产品符合对应开发阶段的质量目标产品概况的要求。另外，还应采取措施避免病毒载体在制备、贮存、运输的整个过程中发生混淆、污染与交叉污染等。153.140、 制备规模和批次定义不同类型病毒载体的生产用细胞类型、生长特性、病毒载体产量和稳定性等存在较大差异，制备工艺成熟程度及病毒载体使用量等也不尽相同，建议结合待基因修饰细胞的特性、病毒载体的工艺和临床使用需求等，合理确定病毒载体的制备规模。病毒载体制备规模需与细胞终产品研究阶段（临床试验、商业化制备）相适应。工艺中可能包括生产用细胞培养、质粒转染或病毒感染、收获、纯化等步骤，制备过程中的上、下游工艺规模需尽量匹配且合理。对于较小的规模，建议关注不同批次间的质量一致性。根据病毒载体工艺特点，制定批次定义和编号规则。如有需要，可明确制备过程中不同工艺步骤，特别关注如有分批和合批的操作步骤时的批次定义和41、编号规则。确保病毒载体批次的可追溯性。3.2 工艺研究与开发用于制备病毒载体的工艺有多种，包括通过质粒.DNA 瞬时转染包装细胞基质制备，通过稳定的生产用细胞系制备，或通过病毒种子感染细胞基质制备。鼓励结合质量源于设计和全过程控制等新理念，以及对相关风险控制的一般要求开展工艺研究。随着生产经验的积累和质量属性认识的加深，不断优化工艺，最终完成实验室工艺到商业化规模工艺的转化。制备工艺一般可以分为上游、下游两个阶段，即上游病毒载体收获阶段和下游病毒载体纯化阶段。制备过程中的生产用细胞种类、细胞培养条件、转染或感染条件、收获时间、纯化步骤及贮存条件等均会影响病毒载体的包装效率和质量。研究中需对工艺42、步骤、关键工艺参数及其控制范围进行研究、确认或验证，并建立相应的过程控制标准。例如，复制型病毒（Rpetent.virus,.RCV）是过程控制中的安全性风险关注点之一，应根据病毒载体种类、工艺特点等开展风险评估，在制备过程中选择合理的检测点（如病毒载体收获液、生产终末期细胞或纯化后的病毒载体原液等），采用经验证的方法开展检测。另外，基于风险，结合病毒对于理化条件的耐受性，必要时，还需根据生产用细胞类型、辅助病毒使用、纯化工艺特点等建立相应的病毒去除/灭活步骤并进行充分的验证。下文以.-逆转录病毒载体和慢病毒载体为例分别对稳定产毒和质粒转染两种制备工艺进行介绍。其他病毒载体和其他制备方式，如适43、用，也可参考。3.2.1 稳定产毒制备工艺研究（1）制备以.-逆转录病毒载体为例，制备时其由稳定产毒细胞分泌至培养液中，可经过澄清16过滤等步骤纯化获得病毒载体。建议根据病毒载体的结构特性、包装机制、稳定性等制定合理的工艺步骤和参数，关注制备过程中的细胞培养体积、接种密度、培养条件、收获时间等。例如，有报道称由于.-逆转录病毒载体的一些包膜蛋白在通常细胞培养条件（37）下的稳定性较弱，针对该情况建议开展研究，制定相应的病毒制备和收获策略，以确保病毒载体的活性和回收率。（2）纯化根据.-逆转录病毒载体的结构特点、宿主细胞的种类、杂质残留的成分等,设计合理的纯化工艺，以提高病毒载体的纯度，降低杂质44、残留的安全性风险。例如，某些病毒载体的包膜蛋白可能对层析工艺比较敏感（如剪切力），因此，鼓励开发先进的纯化工艺，在满足病毒载体结构稳定性和功能活性的基础上，尽可能提高病毒载体的纯度，实现病毒载体的规模化纯化。3.2.2 质粒转染制备工艺研究（1）包装与制备以慢病毒载体为例，用于质粒转染的病毒包装细胞通常采用贴壁或悬浮方式培养，细胞培养方式建议根据规模、制备工艺设计和质量研究等选择以满足商业化制备的需求。病毒包装工艺的研究包括对质粒浓度、质粒比例、转染试剂及浓度、诱导试剂浓度（如有）、转染时间、细胞密度、细胞培养基组分、细胞培养环境（温度、pH、溶氧）、收获时间、收获次数等参数的优化。根据研究，45、确认工艺步骤、关键工艺参数及其控制范围，并建立相应的过程控制标准。例如在细胞培养过程中定期检测细胞活率和生物负荷，开展载体滴度、支原体和外源性病毒等检测，并进行复制型慢病毒（RCL）检测等。载体收获液如需贮存，需开展相应的研究以确认贮存条件、贮存方式等。对于外源因子检测，建议尽量提高检测方法的灵敏度，在适宜的检测点（如外源因子富集的阶段）进行检测。（2）纯化目前，慢病毒载体的纯化工艺通常采用核酸内切酶去除附在病毒载体表面的大片段核酸杂质，经澄清、过滤及离子层析或分子排阻色谱等纯化步骤进行杂质的去除，最后经制剂、除菌过滤、灌装制成病毒载体以备使用。根据研究，纯化工艺可以进行适当的调整和优化，研究46、确定各纯化工艺步骤以达到去除杂质，纯化病毒的目的。如适用，工艺研究中建议对核酸酶浓度、纯化方式、介质选择、动态载量、流速、回收率、病毒载体贮存条件、灌装工艺参数等进行研究，并对核酸酶残留、BSA.残留、风险元件残留（如腺病毒.E1.和17SV40LT.抗原序列残留）、质粒.DNA.残留、宿主蛋白残留、宿主.DNA.残留及转染试剂残留等杂质的去除率进行研究。纯化工艺过程中需加强过程控制检测或质量研究，如生物负荷、内毒素、物理滴度、转导滴度等。3.3 工艺验证制备工艺锁定后需开展工艺验证以对各步骤的工艺进行确认，如适用，可以包括细胞扩增和载体制备各个步骤的验证、中间产物贮存条件和时间验证、杂质清除47、验证、培养基模拟灌装验证、层析柱和超滤膜循环使用次数和除菌滤器的验证以及运输验证等。通过工艺验证证明制备工艺及其在设定的工艺参数范围内可持续、稳定的开展生产，病毒载体的产量和回收率应相对稳定，对残留的核酸酶、宿主细胞蛋白、宿主细胞.DNA、质粒.DNA、细胞碎片、转染试剂等杂质，应有效清除至低于质量标准范围或经过验证研究的水平。鼓励建立上、下游规模匹配的制备工艺，如果在制备过程中出现合批和/或分批的情况，需结合实际制备情况进行充分的研究验证，根据研究结果制定合批和/或分批的原则及具体操作规范。用于合批的样品在合批前应经过检验确认为合格样品。4.质量研究与质量标准4.1 质量研究鼓励运用先进的分48、析方法，多角度、多层面地开展质量研究。分析方法需经过研究和确认，确保结果的准确、可靠。一般建议采用多个代表性批次开展质量研究，常见的研究项目包括外观、病毒载体形态、鉴别、整合特征（如适用）、病毒载体滴度、生物学活性、纯度、杂质（如复制型病毒、风险元件残留、外源因子）等。根据研究结果，确定关键质量属性。4.1.1 鉴别与序列确认可从病毒载体的整体水平、蛋白水平和核酸水平进行检测。整体水平方面，可采用电子显微镜观察、免疫血清学等方法分析鉴别。蛋白水平方面，可采用蛋白质电泳、免疫印迹等分析方法对载体的结构蛋白、表达产物、蛋白表达谱、免疫标记、表型特征等开展分析。核酸水平方面，建议对病毒载体进行全基因49、组测序以确认序列。需特别关注目的基因及调控元件序列的完整分析，对比分析测定序列与预期序列的一致性。对于整合型病毒载体，也可将病毒载体转导目的细胞后，对整合有载体序列的细胞基因组进行测序，验证载体骨架及目的基因序列的准确性。另外，还可采用限制性酶切图谱分析、聚合酶链式反应18（Polymerase.chain.reaction，PCR）等方法对病毒载体和目的基因进行鉴别。鉴别试验应设置合适的阳性和阴性对照。4.1.2 整合特征对于整合型病毒载体，建议选用适用的方法，研究载体整合至目的细胞基因组的典型特征，包括优势插入位点、插入拷贝数、优势克隆异常生长等。关注是否存在病毒载体优先整合至目的细胞基因50、组癌基因附近的情况及其他潜在的致癌风险。4.1.3 病毒载体滴度滴度是病毒载体生物学活性和含量的重要检测项目，可用于工艺过程监控和放行检测，需选择灵敏度、准确度、精密度等符合要求的检测方法开展研究。鼓励采用多种方法进行滴度的检测，并探索不同方法检测数值的相关性。滴度检测包括物理滴度（病毒载体总颗粒数）和转导滴度（病毒载体感染性颗粒数）。研究中需使用标准品或对照品来校准滴度检测结果。可以通过病毒载体中感染性颗粒与总颗粒的比例，用于比较不同批次之间和载体制备的不同阶段之间的质量特征。物理滴度：物理滴度：载体特定蛋白/核酸的定量可用于载体颗粒数量（物理滴度）的估计。例如，HIV-1.衍生的慢病毒载体51、，常用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测载体样本中的.p24蛋白从而进行物理滴度的检测，检测结果可以.p24.蛋白含量/ml.或颗粒数/ml.表示，检测时应关注游离.p24.蛋白对结果的影响。此外，载体基因组拷贝数的定量也可用于物理滴度的估计，检测时建议关注外源.DNA.的干扰。若采用新技术检测，如病毒计数仪法、纳米颗粒跟踪分析法、场流分离-多角度激光光散射法等，建议关注方法对待测病毒载体类型的适用性。转导滴度：转导滴度：可使用基于细胞的体外检测方法检测病毒载体的感染能力。通常待测病毒载体感染细胞一定时间后，通过细胞基因组定量.PCR、流式细胞术、组织/细胞病变或形成噬斑等方法检测，计算出病52、毒载体的转导滴度，检测结果通常以转导单位（TU/ml）、半数组织培养感染剂量（TCID50）或噬斑形成单位（PFU）等表示。4.1.4 生物学活性一般指将目的基因转移到目的细胞的能力以及目的基因表达产物的生物学效应，其中基因转移能力也与病毒载体的转导滴度相关。生物学活性研究贯穿在整体研究开发过程中，建议在研发早期建立生物学活性检测方法；上市阶段，建议根据载体的作用机制和质量属性，尽可能确定与实现预期功能（替代、补偿、阻断、修正特定基因作用等）相关的生物学活性检测方法，必要时，建立合适的标准品。由于病毒载体的生物学活性发挥可能在细19胞终产品中体现，因此，也可以结合终产品的生物学活性综合评价病毒53、载体的生物学活性。4.1.5 纯度和杂质（1）载体相关杂质：（1）载体相关杂质：与病毒载体相关的典型杂质可能包括错误包装颗粒、缺陷干扰颗粒、非感染性颗粒、空衣壳颗粒、聚集体或复制型病毒等，建议采用适用的方法，例如高效液相色谱、电泳法、毛细管电泳法、紫外吸收光谱法等进行研究。通过病毒载体中总颗粒与感染性颗粒的比例，也可以反映病毒载体的纯度和杂质情况。另外，在核酸水平，可以考虑鉴定具有缺失、重排、杂交或突变序列的载体等相关杂质，以含量比率的形式报告检测数值，必要时应纳入质量标准。（2）复制型病毒的检测：（2）复制型病毒的检测：采用复制缺陷型或条件复制型病毒载体时，需在工艺的适当阶段检测制备过程中可54、能产生的具有复制能力的病毒，并根据细胞终产品给药剂量、病毒载体风险等确定残留量的标准限度。复制型病毒与产品的安全性相关，需参考相关研究经验或文献，研究并建立灵敏的检测方法。常见的检测方法包括指示细胞培养法、直接qPCR.法等。待测样品包括病毒载体制备过程中收获的病毒载体收获液、生产终末细胞和细胞终产品等。方法开发时，需关注各检测方法对应的操作流程、样本量、阴性对照、阳性对照、检测标志物、检测限、判定标准等方面的设定和验证研究。建议根据所用病毒包装系统设计特异的检测标志物，如适用，研究中鼓励同时采取两种以上基于不同原理或针对不同标志物的检测方法，从而提高复制型病毒的检出率。当采用指示细胞培养法时55、，需选择合理的扩增细胞和指示细胞，并应考虑待检样本对指示细胞生长的抑制作用等，研究、设置合理的待测样本滴度范围，并建议设置干扰组对照。复制型逆转录病毒（RCR）检测：根据目前的研究技术水平，建议采用敏感的指示细胞培养法对-逆转录病毒载体进行.RCR.检测。RCR.扩增细胞与待测样本进行共培养以最大程度扩增.RCR，在一定传代次数和时间的传代培养后取适量上清接种.RCR.指示细胞培养，以观察、计数细胞病变集落或者进行.RCR.标志物的检测。复制型慢病毒（RCL）检测：根据目前的研究技术水平，建议采用指示细胞培养法对慢病毒载体进行.RCL.检测。对于.HIV.衍生的慢病毒载体，其.RCL.检测所用56、阳性对照可考虑使用满足检测要求的.HIV.病毒，如缺乏辅助基因的，同时具有复制能力的病毒，研究并评估阳性对照病毒的结构和制备方法，并在符合要求的环境中妥善操作和使用。RCL 检测指标方面，通常认为.p24.蛋白、逆转录酶活性、psi-gag 和.VSV-G.序列等的检出可反映.RCL.的存在，结合病毒载体具体情况和研究情况，选择合适的检测指标。（3）工艺相关杂质：（3）工艺相关杂质：可能包括残留宿主细胞蛋白、非目的核酸序列、辅助病毒污染物（如传染性病毒、病毒.DNA、病毒蛋白等）和工艺中所使用的试剂残留，例如细胞因子、生长因子、抗体、转染试剂、磁珠、核酸酶、血清和溶剂等。20以非目的.DNA.57、残留为例，其可能包括与病毒载体共纯化的残留宿主.DNA、质粒.DNA.等，是常见的工艺相关杂质。包装过程中病毒载体的衣壳内部也可能共包装非目的.DNA，这些杂质可能对产品质量和安全性产生不利影响，建议优化工艺，以减少其污染。必要时，对残留的非目的.DNA.序列进行确认和含量的监测。当生产/包装细胞为肿瘤来源的细胞、致瘤细胞系或携带有致癌基因序列等需要高度关注的细胞时，在优化工艺、降低其残留的基础上，还建议控制非目的.DNA.片段大小（建议在.200bp.以下），并对已知的高风险基因进行专项监测。例如，采用.HEK293T.细胞进行慢病毒载体制备时，需采用具有足够的灵敏度和特异性的方法检测腺病毒58、.E1.和.SV40LT.抗原序列的残留。4.1.6 其他微生物污染物：微生物污染物：检测可能引入的污染物，包括外源病毒、细菌、真菌、支原体、细菌内毒素等。理化检测：理化检测：常规的理化检测项目可能包括外观（颜色、透明度）、可见异物、不溶性微粒、pH、含量、渗透压等。4.2 质量标准质量标准是质量控制的重要部分，包括检测项目、检测用方法学和各检测指标的可接受标准。检测阶段一般包括放行检测和/或过程控制等。根据现有研究认知，病毒载体的质量标准检测项目通常包括外观、鉴别、纯度、含量/滴度、生物学活性、杂质、无菌性、细菌内毒素、支原体和外源病毒因子等。检测用方法需经过研究与验证以确保检测结果可靠和准59、确。如适用，尽量建立对照品/标准品，并对其开展相应的质量研究、含量/活性的标定、确定贮存条件等。一般情况下，可接受标准的制定依据包括产品质量设计、质量研究、工艺开发、验证研究、方法学研究与验证、多批检测和稳定性结果，以及合理的统计学方法等。（二）非病毒载体类基因修饰系统非病毒载体类基因修饰系统可通过物理、化学或生物转导方式递送进入细胞。进入目的细胞后，通过转录、剪切、翻译等方式发挥作用，其活性组分为.DNA、RNA 或蛋白质，也可能为核酸与蛋白质组分的组合。1.分子设计非病毒载体类基因修饰系统的设计影响目的基因修饰或目的基因表达的特异性、准确性和有效性，也影响基因修饰细胞终产品的安全性和有效性60、，构建时需要对设计和改构的21利弊进行权衡分析。对于.DNA.类基因修饰系统，开发过程中需关注基因转导效率、脱靶效率、插入突变情况、目的基因在目的细胞中的整合位点及拷贝数等。采用的设计策略包括基因密码子优化、染色体同源序列的改构、富含.GC.区序列的改构、信号肽以及合理启动子的应用等。目前体外基因修饰常用的环状 DNA.类基因修饰系统，包括质粒、微环（Minicircle）DNA、纳米质粒（Nanoplasmid）等不同类型。不同类型环状.DNA 的选择可重点关注高纯度载体制备的难易程度、载体重组、细菌来源.DNA.序列在目标细胞内的表观遗传修饰对目的基因表达的影响等。此外，环状.DNA.类基61、因修饰系统内可引入特殊的.DNA.片段，形成游离型载体，如引入.EBV.来源的顺式作用.DNA.片段.OriP.和反式作用的.EBNA1.基因的载体，此类载体需关注种属、细胞类型对游离型载体功能的影响，载体重组、顺式/反式作用.DNA.片段对目的基因表达的影响等。对于.RNA.类基因修饰系统，以.mRNA.为例，根据目前的研究进展，考虑到设计对.RNA.的稳定性和其在目的细胞内的生物学活性等可能具有显著影响，构建时可以关注碱基修饰类型和比例、5-帽或帽类似物结构、非翻译区序列、Poly（A）加尾结构和自扩增元件（如有）等，并同时进行密码子优化、调控碱基间作用力及高级结构等方面的改造，以实现预期62、的功能。对于基因编辑系统，建议对靶向序列、目的基因序列（如有）和基因编辑用酶等的序列和比例等进行优化。通过特定细胞中的基因编辑效果确认基因编辑用酶和靶向序列的特异性，筛选最佳的靶向结合序列（如.sgRNA.序列），并采取措施降低基因脱靶、插入突变的概率及对目的细胞基因组稳定性的不良影响。对于转座子系统，建议考虑整合位点的特异性和分布趋势，.以及转座子在基因组中的移动（genomicmobilization）等特征，进行转座子序列、转座酶及相应调控元件的优化，合理设置转座序列/转座酶的比例、序列分布等。2.生产用物料基本原则可参考病毒载体类基因修饰系统部分的相关要求。对于采用重组技术或生物/化学63、合成技术制备的生产用原材料，需明确工艺和质量控制情况，特别是需要分析生产过程中可能引入的安全性相关杂质。对于制备过程中使用的酶类试剂，建议重点关注酶的功能活性，例如需关注所用 DNA.聚合酶、RNA.聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特异性消化条件等，同时需要关注酶的纯度、生产过程中引入的杂质等。对于核苷酸、5-帽或帽类似物等原材料，其整体的质量应符合制备的要求，建议关注鉴别、浓度、纯度和杂质等。制备过程建议避免使用氯化铯、溴化乙锭、氯仿等毒性物质，避免使用动物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等风险的22原材料。对于用作递送系统的材料，其制备涉及的关键原材料（脂质、阳离子聚合物64、等）需进行充分的筛选和质量控制。3.制备工艺基本要求同病毒载体类基因修饰系统。对于体外基因修饰后直接制备细胞产品的情况，需要多次、规模化的制备，具体情况介绍如下。3.1 DNA 类基因修饰系统以质粒.DNA.为例，其制备步骤一般包括微生物培养及发酵、菌体收集、菌体裂解、质粒纯化、浓缩、灌装等。工艺研究与确定过程需对关键工艺参数进行探索和优化，建立稳定的制备工艺。关键工艺参数可能包括发酵培养基组成、发酵培养温度、补料培养基组成、补料时间和补料量、溶氧量、碱裂解缓冲液及中和缓冲液的组成、碱裂解时间、层析柱载量、层析流速等。研究中建议关注制备全过程对质粒结构和功能可能的影响，如碱裂解步骤可能产生的质65、粒不可逆变性的情况等。纯化工艺开发过程中，可以根据质粒的实际大小和性质选择合适的柱层析填料，最大程度去除宿主 RNA、宿主.DNA、DNA.碎片和细菌内毒素等杂质。根据研究，设置合理的过程控制指标和可接受标准，如质粒中间产物的浓度、超螺旋比例、杂质残留量等。3.2 RNA 类基因修饰系统基于研究现状，RNA.的制备一般包括体外化学合成和 DNA.转录两种工艺路线。体外化学合成工艺请参考化学药物的相关技术指南。DNA.转录工艺路线以.mRNA.的制备工艺为例，该工艺一般采用.DNA.转录模板进行.mRNA.体外转录、mRNA.加帽、去磷酸化、DNA.酶处理、mRNA.纯化等步骤。建议对工艺参数进66、行研究与优化，开发稳健的工艺，确保.mRNA.序列正确性、结构完整性、生物学活性和不同批次间质量的一致性。对工艺中引入的潜在杂质进行研究，明确杂质的来源、去除步骤和去除能力等。工艺研究中需对关键工艺参数及控制范围进行确认，如.NTP.浓度、转录时间、反应温度、加帽反应物料投料比、层析介质、动态载量等，关注产品回收率、杂质去除率、加帽率、poly（A）长度及分布（如适用）、mRNA.片段的完整性以及序列的准确性等方面。制备过程中需设置合理的过程控制指标，如 mRNA.浓度、双链.mRNA.含量、不完整.mRNA.含量、残留DNA、无菌、细菌内毒素等。3.3 其他基因修饰系统如含有重组蛋白质成分，67、根据具体情况，可以参考重组蛋白质类生物制23品生产的相关技术要求。4.质量研究与质量标准4.1 质量研究质量研究通常包括鉴别、结构特征、理化特性、生物学活性、纯度和杂质分析等。研究中建议采用多个代表性批次开展研究。如含有化学合成的组分和/或重组蛋白组分的，可参考相关指导原则等开展质量研究。鉴别和序列确认：鉴别和序列确认：鉴别研究中，可采用限制性内切酶进行酶切，对酶切产物进行电泳分析，观察是否存在特征性的带型；也可以用.PCR.方法进行扩增，分析片段大小是否与理论大小一致等方法。对于.RNA，可将其逆转录为.DNA.后，采用上述方法进行鉴别，或考虑采用其他适用的方法。序列确认研究中，建议开展全序68、列测定，重点关注目的基因和调控元件的序列正确性，对于.RNA,.如有，建议同时关注.poly（A）序列的正确性。结构：结构：建议采用适用的方法对结构完整性和大小均一性进行研究。如对于.DNA，可关注其是否存在单链、双链、线性/开环、环状和超螺旋等多种结构形式，以及可能的高级结构等；对于.mRNA，可关注其不同区域结构的完整性（如.5-帽或帽类似物结构、poly（A）长度）、碱基修饰结构、去磷酸化程度以及可能的高级结构（如茎环结构）等。若功能活性与高级结构相关，建议分析研究高级结构特征。对于复合核酸类基因修饰系统，建议开展结构分析，如关注复合结构的粒径大小、粒度分布、颗粒聚集等。理化特性：理化特69、性：建议开展分子量、核酸浓度/含量、修饰位点及比例（如有）、物理特性（如.pH、渗透压）等方面的研究。生物学活性：生物学活性：根据作用机制，生物学活性研究通常包括对基因修饰效率、目的基因表达的水平、表达产物的功能或体外模拟生理功能的测定等。建议首选定量检测方法，如可通过目的基因或基因编辑产物的表达量和功能进行分析，关注表达产物是否与预计一致或蛋白表达/基因是否被抑制、空间结构是否符合设计（如多聚体）等。当采用体外转染检测细胞的方法时，需关注选择的检测细胞是否具有代表性和合理性。纯度：纯度：可以采用琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等方法开展纯度的研究。对于复合核酸类基因修饰系统，建议关注70、包封率、游离核酸含量等。杂质：杂质：一方面，杂质可能来自原材料、制备过程、制备和贮存过程中直接接触容器和材料的溶解物。如.DNA.模板、酶类试剂、磁珠等原材料和添加的成分；乙醇、异丙醇等有机溶剂；宿主蛋白残留、宿主.DNA.残留、宿主.RNA.残留等。另一方面，与基因修饰系统相关的杂质，可能包括缺失、重排、杂交或突变序列等相关杂质，建议进行定性和定量的相关研究。对于.DNA.类基因修饰系统，相关研究可以包括开环/线性.DNA.含量、过度甲基化修饰的分子等。对于 mRNA.类基因修饰系统，相关研究可以包括降解/断裂产生24的.RNA.片段、加帽不完全的.mRNA、修饰过度的.RNA、RNA.错配71、序列、RNA.氧化产物等。结合制备工艺的杂质清除能力，采用适用的方法对杂质的残留水平进行分析，评估相关安全性风险。微生物安全性：可结合工艺过程，检测可能引入的污染物，包括细菌、真菌、支原体（如适用）、细菌内毒素等。其他特性研究：其他特性研究：对于使用基因编辑工具酶的修饰系统，质量研究中建议持续关注对应细胞产品中修饰系统的残留情况，采用生物信息学工具分析靶细胞基因组结构变化、单点和小规模基因突变以及外源.DNA.在基因组中的插入位置、拷贝数等，监控基因编辑用酶的细胞内持续表达时间，考察脱靶效应及相应的安全性影响等。4.2 质量标准根据风险分析，结合工艺研究与验证、临床试验及商业化批次质量分析、稳72、定性研究数据等制定合理的质量标准，明确各检测项对应的分析方法、标准限度范围并建立标准品/参考品等。对于一般工艺相关杂质，如经充分验证证明工艺可对其有效、稳定地清除，可结合工艺进行控制，相关残留检测可考虑不列于检定项目中。质量控制项目可以包括理化性质、纯度和杂质、生物学活性、微生物安全性等。其中，DNA.类的质量标准可以纳入外观、pH.值、含量、鉴别、序列分析、纯度、超螺旋比例、生物学活性、无菌检测、细菌内毒素、杂质残留等检测项目。mRNA.类的质量标准可以纳入外观、pH.值、含量、鉴别、序列分析、mRNA.完整性、加帽率、poly（A）长度及分布、生物学活性、无菌检测、细菌内毒素、双链.RNA73、 残留、溶剂残留等检测项目。常见的复合核酸类基因修饰系统的质量控制项目包括外观、pH、颗粒大小及分散系数、渗透压、鉴别、序列测定、含量/浓度检测、生物学活性、纯度、序列完整性、包封率、复合材料各组分含量（例如脂质鉴别和含量）、游离核酸、可见异物、杂质、微生物安全性等。方法学研究与验证方面，基本原则同病毒载体类基因修饰系统的要求。六、稳定性研究与直接接触性容器/材料研究（一）稳定性研究基因修饰系统如涉及到贮存，则需开展相应的稳定性研究。采用拟贮存阶段样品的代表性批次开展研究，一般包括贮存、运输（如适用）和使用稳定性研究等。研究开展前，需统筹制定稳定性研究方案，关注各稳定性研究所用样品、直接接触性74、容器/材料、检测时间点、检测条件和分析检项等。研究中需对能够反映质量变化的敏感特征进行研究，如含量、完整性、纯度、微生物25安全性和生物学活性等。研究中需涵盖拟定的各项条件，如温度、光照、反复冻融（冷冻贮存时）、振摇等方面。根据实际使用情况，开展使用中稳定性研究，例如复溶或解冻，与复溶稀释剂的相容性等研究。研究中需采用与实际使用相同材质的直接接触性容器/材料。对于病毒载体类基因修饰系统，稳定性研究中建议重点考察病毒载体的滴度、纯度、杂质、微生物安全性指标、生物学活性等关键质量属性。对于非病毒载体类基因修饰系统，建议重点关注理化特性、结构完整性、杂质等关键质量属性。例如，DNA.超螺旋结构的比例75、可能影响.DNA.的转染率，mRNA.加帽率可能影响.mRNA.的结构稳定性和翻译效率，建议在稳定性研究中重点考察。（二）直接接触性容器/材料研究如涉及贮存，需对直接接触的包装容器开展相应的包材相容性研究。根据相容性研究结果，结合稳定性研究，选择合理的包装容器。另外，对制备工艺中与样品接触的容器和一次性使用材料（如贮存袋、过滤膜、层析介质、管路等），需开展风险评估和/或相应的相容性研究。七、参考文献1.U.S.FDA.Chemistry,.Manufacturing,.and.Control.(CMC).information.for.human.gene.therapy.Investigat76、ional.New.Drug.applications.(INDs).2020.2.国家食品药品监督管理总局.细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行).2017.3.EMA.Guideline.on.development.and.manufacture.of.lentiviral.vectors.2005.4.国家食品药品监督管理总局.生物制品稳定性研究技术指导原则（试行）.2015.5.EMA.Quality,.preclinical.and.clinical.aspects.of.gene.therapy.medicinal.products.2018.6.ICH.Q5A.Viral.77、safety.evaluation.of.biotechnology.products.derived.from.cell.lines.of.human.or.animal.origin.1999.7.ICH.Q5C.Stability.testing.of.biotechnological.and.biological.products.1995.8.ICH.Q5D.Derivation.and.characterization.of.cell.substrates.used.for.production.of.biotechnological/biological.products.19978、7.9.U.S.FDA.Testing.of.retroviral.vector-petent.retrovirus.during.product.manufacture.and.patient.follow-up.2020.10.EMA.Guideline.on.quality,.non-clinical.and.clinical.aspects.of.medicinal.products.containing.genetically.modified.cells.202026细胞和基因治疗产品临床相关沟通交流技术指导原则2023 年 12 月27一、概述（一）前言近年来，随着细胞和基因治疗79、相关科学理论、技术手段、临床医疗实践的不断进展，以及监管政策的逐渐完善，细胞和基因治疗产品的临床研发获得快速蓬勃发展。目前，在全球范围内已有多款、多种类型的细胞和基因治疗产品获批上市，国内也有治疗恶性血液肿瘤的嵌合抗原受体 T 细胞（Chimeric.antigen.receptor.modifiedT.cells，CAR-T）产品上市，多款治疗不同适应症的细胞和基因治疗产品进入上市申报阶段或关键/确证性临床研究阶段，还有更多的各种类型的细胞和基因治疗产品正处于早期/探索性临床试验阶段或计划申请注册临床试验阶段。因此，此类产品的临床相关沟通交流也与日俱增。细胞和基因治疗产品不同于传统小分子或生80、物大分子药物，产品的设计和制备工艺可能涉及细胞的采集、体外培养扩增、分离纯化、活化，或载体选择、基因修饰、基因编辑等复杂操作，且常随着相关研究理论和技术的发展而进行迭代和更新。细胞和基因治疗产品自身的个性化和特殊性决定了其作用机制、体内行为、治疗效果及其不良反应具有其各自不同的特点。细胞和基因治疗产品新技术的应用，一定程度上拓宽了治疗新思路，提供了新的治疗策略，但其产品设计和制备的复杂性，也可能增加潜在的安全性风险等。为了探索此类产品的最优开发路径，并对已知和潜在风险做出充分评估和管理，有必要根据不同的产品特点制定各自的临床研发计划、临床试验方案以及风险管理计划等。上述临床研究资料由于细胞和基81、因治疗产品自身的特点而具有一定的特殊性，申请人在开展临床试验前以及临床试验期间都需关注产品特征、临床定位、适用人群、给药方案、试验设计等临床研究的关键因素。本指导原则主要是针对上述因素以及在不同阶段沟通交流中关注内容的一般考虑。对于药物临床试验需要遵从的一般原则以及与其他指导原则的重复内容在本指导原则中不再赘述。（二）目的和适用范围本指导原则适用于按照中华人民共和国药品管理法、药品注册管理办法等药品管理相关法律法规等进行研发和注册申报的具备细胞和基因治疗属性的产品。本指导原则涉及的细胞和基因治疗产品主要包括人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品、免疫细胞治疗产品、基因治疗产品等。本指导原则旨在为细胞82、和基因治疗产品临床研发过程中沟通交流的资料准备和临床研发要素考虑等提供建议，以期提高沟通交流效率，助力细胞和基因治疗产品的临床研发能顺利推进。本指导原则是对细胞和基因治疗产品临床方面沟通交流相关技术问题的建议和推荐，28不具有强制性的法律约束力。本指导原则仅代表药品监管部门当前的观点和认知。随着细胞和基因治疗产品研发的深入和经验积累，以及政策的更新，本指导原则中的相关内容将不断完善与更新。建议申请人及时与药审中心就细胞和基因治疗临床研究的具体设计和细节进行沟通。二、沟通交流的关注内容（一）主要研发节点沟通交流的目的1.临床试验申请前沟通交流细胞和基因治疗产品首次临床试验申请前，申请人原则上应向83、药审中心提出沟通交流申请，以讨论和解决首次递交临床试验申请前的重大技术问题，并在确保受试者安全的基础上，确定临床试验申请资料的完整性、实施临床试验的可行性。2.关键/确证性临床试验启动前沟通交流关键/确证性临床试验前的沟通交流，主要探讨现有研究数据是否充分支持拟开展的关键/确证性临床试验，并对关键/确证性临床试验方案等进行讨论。申请人还可针对申报上市计划/策略进行初步介绍。3.上市许可申请前沟通交流根据药物研发与技术审评沟通交流管理办法相关规定，治疗用生物制品上市许可申请前，申请人原则上应向药审中心提出沟通交流申请，主要探讨现有研究数据是否满足药品上市许可的技术要求。申请附条件批准和/或适用优84、先审评审批程序的，应与药审中心沟通交流确认后，方可向国家药品监督管理局递交药品上市许可申请。拟申请附条件批准上市的，药品上市许可申请递交前，申请人应当讨论附条件批准上市的条件和上市后继续完成的研究工作等。（二）沟通交流的重点项目1、立题依据一般包括：产品的设计原理、作用机制、目标适应症概述及产品在目标适应症中的潜在临床优势和临床定位。立题依据的分析和阐述一般在提交临床试验申请前的沟通交流时提交，并在产品研发过程中对产品临床定位和临床优势等不断进行完善。291.1 产品的设计原理和治疗的作用机制由于细胞和基因治疗产品制备、生产和治疗方式等多涉及新原理、新技术，且目前此类产品基本都属于创新药，不同85、类型产品之间设计原理和治疗机制差异很大，同类产品之间也存在差异，对产品的设计原理和治疗的作用机制进行详尽的说明有利于解释其治疗特点和优势等。申请人在提交临床试验申请前的沟通交流时，要对产品的设计原理、治疗的作用机制做出较为详尽的介绍和说明，提交相应的药学与非临床研究结果或进展，确保该产品在设计、制备等方面可为将来的临床试验提供具有较为可靠的安全性和有效性基础。1.2 目标适应症概述及产品在目标适应症中的潜在临床优势和临床定位立题依据的阐述还需要在充分了解目标适应症的基础上，对所申请适应症的现有治疗手段进行总结，明确临床需求，确定产品的临床定位。目标适应症的概述可包括，但不限于：疾病的定义、发病86、机制、流行病学概况（例如：地区分布、时间分布、人群分布）；疾病的分型/分期、常用的诊断和疗效评价的标准和方法、现有标准治疗手段及尚未满足的临床需求等。在提交临床试验申请前的沟通交流时，还建议对国内外同类产品与本品拟定研究相关的研究应用进展进行概括总结，在对现有治疗和同类产品了解的基础上，分析产品的特点和潜在优势，初步确定临床定位。随着产品临床研究的开展，通过对研究人群进行亚组分析和敏感性分析等，可能收集到更多关于目标人群用药安全性和有效性信息，故申请人可在关键/确证性临床试验启动前沟通交流中讨论关于细化适应症人群相关问题。2.临床研发计划和临床试验方案申请人在临床试验申请前沟通交流时应制定并提87、交临床研发计划和临床试验方案，有助于增进监管机构对申请人提出的针对临床研发计划和临床试验方案相关具体问题的理解，从而促进充分沟通。在关键/确证性临床试验启动前沟通交流时，申请人应根据已完成临床试验的数据及其分析，科学设计拟开展的关键/确证性临床试验方案，并提交详尽、可行的方案。2.1 基本内容特点，可参考同类产品研发进展而制定。可包括，但不限于：产品概述、总体研发计划。总体研发计划至少需包括拟定适应症、临床前评估、临床评估（如适用）、各阶段研究设计及方案概要、项目时间表等内容。临床试验方案需科学合理、内容完整、并具有可行性。至少包括试验题目（方案编号、版本号、版本日期）、研究目的、试验设计、试88、验30人群（入、排标准）、给药设计、样本量、试验终点、试验流程等重要内容。2.2 临床试验方案的关键因素临床试验方案的设计需与产品的立题及其临床定位相统一，例如：试验人群的选择和试验的设计需满足研究目的，研究终点指标的选择能体现试验人群的临床需求和产品的特点和/或优势。一般在早期探索性临床试验中的主要研究目的是探索产品安全性，则主要终点指标设置为安全性观察指标等。考虑到有些类型的细胞和基因治疗产品安全性风险尚未明确，特别是基因编辑的细胞和基因编辑产品。因此，在临床试验申请前沟通交流时，建议申请人关注临床试验方案中安全性观察指标以及剂量探索时的剂量限制性毒性（Dose.limiting.toxi89、city，DLT）定义等问题。DLT 定义建议从产品自身设计出发，综合考虑产品特点，科学制定，参考国内外同类产品开发经验，不要照搬照抄其他品种。细胞和基因治疗产品剂量探索相关内容，可参考细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）、免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）、人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）、溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则、基因治疗血友病临床试验设计技术指导原则等。针对病因治疗的细胞和基因治疗产品，作用机制不同于传统治疗，在有效性评价时，需注意有效性终点指标需同时体现临床获益和对因治疗的临床优势。建议在早期探索性临床试验中对有效性评价指标进行充分90、探索，为后期临床试验选择合适的有效性终点提供依据。申请人需根据产品的临床定位，选择合适的试验人群和试验设计。例如：当产品的临床定位是解决肿瘤复发后缺乏有效治疗手段，一般入组经充分标准治疗后的末线肿瘤患者，临床试验设计可考虑选择使用单臂/随机对照；如果拟入组试验人群有标准治疗，则可根据现有诊疗指南，明确既往治疗情况，也可参考相同适应症的药物的临床试验，制定入排标准，并且采用与标准治疗平行对照的随机、盲法（如适用）试验。临床试验方案的入排标准要明确具体，例如：设置针对基因治疗载体的中和抗体的阈值；根据适应症的诊疗现状明确既往治疗的线数，以及每线治疗经充分治疗的含义等。目前对某种治疗“充分治疗”的定91、义，一般需包括足够（完整）的治疗周期，或无法完成完整治疗周期的原因，例如：患者对治疗产生的毒性反应“不耐受”，且该“不耐受”的判断需有客观指标的支持。给药方案主要包括给药途径、给药剂量、给药间隔、给药次数和给药周期等。细胞和基因治疗产品由于其产品类型的特殊性，非临床研究为给药方案提供的参考可能有一定的局限性，申请人可在非临床研究的基础上，参考同类产品已完成的及/或正在进行已有初31步数据的临床研究，科学、审慎地制定给药方案。关键/确证性临床试验启动前沟通交流时提交的临床试验方案，需在探索性临床试验的基础上，进一步明确拟确证的适应症人群特征、细化关键入选标准和排除标准、选择合适的给药方案、明确或92、根据研究需要调整主要/次要疗效终点、安全性信息的关注点，并根据研究目的明确统计假设、以及与细胞和基因治疗产品相关的终止、暂停、补救治疗等常见的伴发事件及相应的处理策略等内容。在此阶段，申请人不仅需关注有效性终点指标的选择，还需明确有效性评价的标准以及对评价者的要求，根据不同疾病疗效评价标准的要求，在方案中明确有效性评价的时间点以及对有效性评价确认的相关要求（如适用）。为进一步明确临床定位，在关键/确证性临床试验方案中，申请人需审慎考虑并选择合适的临床试验设计。如果开展随机、盲法（如适用）、对照试验，需重点考虑对照药的选择以及统计假设的设定，对照药的选择需符合产品的拟定临床定位和适应症当前的诊疗93、现状。在一些新型细胞和基因治疗产品的临床研发过程中，由于产品可能存在较高的安全性风险，如果在关键/确证性临床试验时选择单臂试验设计，为了保证这些细胞和基因治疗产品的单臂试验能够提供上市所需的安全性和有效性数据，申请人需在关键/确证性临床试验方案中提供针对疗效评估的统计学假设并明确试验所需病例数。单臂试验中的目标值设定需有足够的依据；试验所需病例数在满足统计假设计算值的基础上，还需考虑有足够的病例完成安全性风险的评估。3.风险管理计划风险管理计划一般需包括药物警戒活动计划和风险控制措施。申请人应在遵守我国药品管理的相关法律法规等的同时，参考国际人用药品注册技术协调会（International.94、conference.on.harmonization.，ICH）和我国药品监管机构发布的相关技术指导原则完成产品的药物警戒活动计划。在批准临床试验前，由于产品可能尚无临床应用的安全性数据，申请人更需充分分析已完成的非临床研究数据，并参考同类产品已发现的安全性风险，基于产品特性，形成较为详实的药物安全性概述和风险控制措施。在临床试验申请前沟通交流阶段，还需注意完善对临床风险管理计划的修订机制，以便在获得临床试验数据时能及时、有效地完善临床风险管理计划。在关键/确证性临床试验启动前沟通交流和上市申请前沟通交流时，申请人需提交根据临床试验结果完善的临床试验风险管理计划和/或基于临床试验安全性总结制95、定的上市后风险管理计划。风险管理计划是动态完善的过程，随着临床研发的推进，安全性概貌逐渐清晰。4.已完成临床试验的总结32在关键/确证性临床试验前的沟通交流时，申请人需对已完成的临床试验进行简要总结，并分析该阶段临床试验的结果是否达到整体研发计划中拟定的目标，并对产品的获益-风险进行初步评估，分析并阐述现有数据是否以及如何支持开展关键/确证性临床试验。可通过总结分析已完成临床试验的数据，对前期试验方案中给药方案的安全性和有效性进行评估，以得出剂量-安全及剂量-效应关系信息。申请人还可对前期临床试验中受试者的人群特征（例如：年龄、性别、职业、种族或民族、婚姻状况等）及其安全性和/或有效性进行分析96、，以总结出接受治疗后获益-风险比较高的人群。此类分析将为进一步确认产品的最佳给药方案以及适应症人群提供参考。另外，在对前期临床试验结果进行总结的过程中，申请人可关注前期初步设计的疗效评估指标是否能体现患者的临床获益，以及受试者接受治疗后在哪些疗效评估指标中的获益较为显著。在上市许可申请前的沟通交流时，申请人需提交关键/确证性临床试验的临床试验初步总结，以及临床试验方案及其修订历史、修订原因，统计分析计划等，并关注关键/确证性临床试验的执行情况是否符合临床试验通知书相关内容（如适用）以及关键/确证性试验前沟通交流达成的共识，重点关注包括，但不限于：入选人群是否与关键/确证性试验前沟通交流时的共识97、一致，特别是疾病类型、既往治疗情况等方面；实际筛选和入组的受试者符合入排标准的详情；受试者筛选失败或出组详情，需提供详细信息以防止出现挑选受试者的情况；统计分析数据集的划分是否合理；有效性和安全性数据集病例数是否达到关键性试验前沟通交流时的共识数量；计入有效性数据集的受试者是否完成有效性终点的评估；疗效评估标准的合理性，以及与关键/确证性试验前沟通交流的差异；敏感性分析是否充分合理；安全性数据的收集和总结是否合理合规；对严重不良事件（SeriousAdverseEvent，SAE）、重点关注的不良事件、死亡事件等进行充分的分析说明；对新发现安全性风险进行分析说明等。5.其他在提出细胞和基因治疗98、产品临床相关沟通交流申请时，由于产品特殊性，其药学和非临床研究数据如果涉及产品安全性、临床安全性风险和风险控制等方面内容，也需提供相关资料。在关键/确证性临床试验前沟通交流时，申请人可简要介绍产品的上市申报计划/策略。根据不同的申报计划/策略，关键/确证性临床试验的关键因素设计可能不同。例如：拟申请完全批准上市或附条件批准上市时，关键/确证性临床试验中统计分析计划和终点指标及随访时间的选择可有不同的考虑。（三）不同细胞和基因治疗产品沟通交流的特殊考虑331.人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品人源性干细胞衍生细胞治疗产品指由人源性干细胞（包括人胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞）诱导分化，或成99、熟体细胞转分化获得的细胞治疗产品。人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品（以下简称干细胞相关产品）的细胞来源多样，在临床试验申请前沟通交流时，申请人需详细介绍干细胞产品的来源、制备等信息，并分析产品的伦理风险，是否支持开展人体临床试验。对于已按干细胞临床研究管理办法（试行）要求开展了备案的干细胞临床研究，并拟用于药品注册申报，需在临床试验申请前沟通交流时提交备案研究设计、方案和结果，并说明备案研究对后续研发规划和临床试验方案等临床试验关键要素制定的支持依据。由于目前干细胞相关产品的治疗机制可能依赖细胞分布、定植、增殖、分泌等功能，所针对的适应症大多数是非危及生命疾病，临床上主要以缓解症状、延缓病情为100、治疗目的，因此在试验设计时，需考虑并及时与药审中心沟通临床试验中的一些关键因素，例如：根据临床定位选择单药或在现有治疗的基础上加载给药；是否以及在哪个试验阶段设置对照组；对照药的选择；不同试验阶段临床终点的选择等。干细胞相关产品可能存在基因修饰。目前针对干细胞的基因修饰主要目的包括改善其扩增及分化能力和降低免疫排斥反应等；此外，也有利用基因编辑工具将外源目的基因整合到干细胞基因组，治疗基因功能缺失的遗传病（如先天性免疫缺陷）和血液疾病等。此类经基因编辑改造后的干细胞相关产品可能会提高治疗效果并扩展干细胞治疗疾病的范围。例如：目前在研产品，有的是修复白介素 2 受体 链（Interleukin2101、receptorsubunitgammachain，IL2RG）基 因 的 造 血 干 细 胞（Hematopoieticstemcells，HSCs），以期治疗 X-连锁重症联合免疫缺陷病；有的为了增强患者对人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiency.virus,.HIV）的抵抗能力，研究者敲除 HSCs 的 CC 趋化因子受体 5（C-C.motifChemokinereceptor5，CCR5）基因；有的敲除 HSCs 的 BCL11.转录因子 A（B-celllymphoma/leukemia11A，BCL11A）基因激活 珠蛋白表达，拟用于治疗镰状细胞贫血和 地中海102、贫血。针对此类产品的临床研发计划、临床试验方案提出沟通交流时，需额外考虑到基因修饰可能会增加致瘤性、扩增或外源基因表达不可控等安全性风险。2.免疫细胞治疗产品免疫细胞治疗产品是指利用患者自身或供者来源的免疫细胞，经过体外培养扩增、活化或基因修饰、基因编辑等操作，再回输到患者体内，通过调整机体免疫功能，从而达到控制疾病的细胞治疗产品。目前免疫细胞治疗产品涉及的细胞类型主要包括：T 细胞、自然杀伤细胞（Naturalkillercells，NK）、树突状细胞（Dendritic.cells，DC）等。34免疫细胞治疗产品的目前主要来源是成体免疫细胞，不同的细胞类型、在体外制备时所接受操作的复杂性、103、以及细胞在体内存续特征和作用机制的多样性，都会影响临床应用的安全性风险；不同疾病分期或严重程度的受试者对免疫细胞治疗风险的接受程度也不同。疾病严重程度更重或更晚期的受试者对免疫细胞治疗风险的接受度更高，或者其病情更能支持承担风险的合理性。但由于对起始细胞质量（例如：自体来源的免疫细胞治疗产品，病情过于严重的受试者可能存在无法采集到合格的制备原材料、无法制备出符合标准的细胞产品）、制备时间等待、以及对合并用药等操作的要求，病情进展迅速和病情严重的受试者可能不是最佳的受试人群，需在临床试验设计时充分考虑产品对研究人群的获益-风险评估，建议在临床试验沟通交流时进行充分说明。目前，接受基因修饰的免疫细104、胞产品主要包括嵌合抗原受体 T 细胞、嵌合抗原受体NK 细胞（Chimericantigenreceptor.modifiedNKcells，CAR-NK）、工程化 T.细胞受体修饰的T.细胞（T-cell.receptor-engineered.T.cells，TCR-T）、靶向肿瘤新生抗原 T 细胞等，此类产品最常用的基因修饰主要是增加 T 细胞、NK 细胞对肿瘤细胞特异性抗原的识别以增强对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。此外，此类产品还可能在免疫细胞中引入一些多肽、抗体等蛋白的基因片段，或者引入影响某些关键基因表达的靶向基因序列等。这些产品的基因修饰过程相对复杂、基因改造后的目的多样，可能带来105、致瘤性、外源基因表达不可控等安全性风险。在提出沟通交流时，不仅需阐述在临床试验开展前对产品安全性进行的充分评估，还需讨论临床试验中安全性和有效性评估指标及其随访时间设置的科学性、合理性。例如：在剂量探索试验 DLT 定义中是否纳入对外源基因过表达相关毒性的监测；在临床试验方案和风险管理计划中针对细胞过度增殖和外源基因过表达设置怎样的监测指标和时间、停止规则和风险控制措施等；设置与基因改造目的和优势相关的哪些有效性评估指标等。对于肿瘤新生抗原 T 细胞以及其他通过大数据筛查选择插入细胞的外源基因的基因修饰细胞治疗产品，需关注在临床试验申请前沟通交流时充分介绍数据筛选的方法学及其依据，保证该方法的106、科学性和稳健性。免疫细胞治疗产品可能涉及较多的个体化制备环节，在沟通此类产品的临床试验设计时，还需特别关注对研究人群筛选、合并用药、桥接治疗、制备失败补救方案（含其他补救治疗、再次制备、受试者替换原则等）、制备及使用过程的一致性等问题。随着 CAR-T 产品研究的发展，已有异体 CAR-T 产品（同种异体来源的 T 细胞制备的CAR-T 细胞产品，也被称为通用型或“现货”型 CAR-T 细胞产品）或体内编辑的 CAR-T.产品申请或进入临床试验。异体 CAR-T 细胞虽然与自体 CAR-T 细胞具有一些共性，但又因其来源于异体，可能具有免疫原性等特点，因而这类产品的临床试验沟通交流，除关注以上107、问题外，还需关注合并用药，例如：抗 CD52 单克隆抗体的来源和使用剂量；基因编35辑技术（例如 CRISPR/Cas9）在体内编辑的安全性和效率问题；还需要关注异体细胞的免疫排斥反应、成瘤性、安全性指标监测时长等。3.基因治疗产品基因治疗产品是指修饰/操纵基因的表达，或改变活细胞的生物学特性，从而达到治疗目的的产品。主要作用机制有正常基因替换致病基因、使不能正常工作的基因失活或者引入新的或修饰的基因等方式。基因治疗产品主要包括：核酸类药物、基于病毒载体的基因治疗药物、基于细菌载体的基因治疗药物、基因编辑系统和体外基因修饰的细胞治疗药物等。基因治疗产品的风险主要源自基因载体及其承载的基因，申请108、人在提出沟通交流时，需在对产品所选择载体的合理性和安全性进行充分研究和探索的基础上，并对产品基因修饰机制、导入的基因做出充分阐述，以评估产品的总体安全性风险。对于通过生物信息学方法筛选目的基因序列和分析产品与患者适用情况的，需阐述该方法学的科学性和稳健性。基因治疗产品种类多样、不同修饰机制的基因治疗产品的预期治疗效果不同，针对的适应症/目标患者群体、产品的给药途径等都存在差异。例如：基于病毒载体的基因治疗药物治疗血友病时采用静脉输注给药；基于病毒载体的基因治疗药物治疗视网膜变性疾病时采.用的视网膜下腔/玻璃体腔/脉络膜上腔给药；裸质粒 DNA 的基因治疗下肢缺血性疾病时采用局部多点注射给药并可109、能需要电转染系统/器械；mRNA“肿瘤治疗性疫苗”治疗肿瘤时采用皮内注射给药。沟通交流时，申请人需结合产品特点、适应症人群的临床需求和基因治疗的预期优势，说明给药途径的科学性、必要性和可行性；对于需要器械辅助给药的，需说明器械作用原理和具体使用方法；对于需外科手术给药的，需阐明给药方式的合理性并提供具体操作步骤。关注不同给药途径的安全性风险和临床获益，例如：静脉输注给药的组织靶向性、局部给药部位/组织器官的反应、局部给药引起的全身反应/远端效应等，提出合适的安全性和有效性评估指标和随访计划，并对给药途径相关风险进行评估并制定控制风险最小化的措施。基因治疗产品通常被期望可达到长期疗效的目的，但同110、时可能增加了不可预测的风险如迟发性不良反应等。因此，申请人在开展基因治疗产品临床试验时，需关注对迟发性不良反应等风险的评估和风险最小化措施。建议在临床试验申请前沟通交流时，考虑引起迟发性不良反应的风险因素，根据总结的风险因素合理制定初步长期随访计划；在关键/确证性临床试验申请前沟通交流时，进一步细化其中的随访时点、随访持续时间、随访指标等内容。在对产品开展临床试验的获益-风险评估环节，阐述长期随访方案、风险管理计划以及知情同意书样稿等文件对于风险的考量和控制，递交安全性评价方案和长期随访方案。随着临床试验期间或上市后获得更多关于产品风险的重要信息，应及时更新相关文件，36并可针对相关问题提出申111、请沟通交流。细胞和基因治疗产品种类多样、机制复杂、给药方案和适应症人群差别较大，在申请沟通交流时，建议申请人基于产品特征，结合各阶段临床试验的目的，开展以关键技术问题为导向的沟通交流。三、注意事项本部分内容主要基于细胞和基因治疗产品临床专业既往沟通交流的经验。（一）沟通交流的时机依据药品注册管理办法、药物研发与技术审评沟通交流管理办法（试行）及修订说明，对于申请附条件批准和/或适用优先审评审批程序的，申请人应当按要求提出沟通交流申请。在药物临床试验批准通知书中，如果包含“在临床试验开展前，就临床试验方案与药审中心进行沟通交流”、“在完成探索性临床试验，开展确证性（或关键性）临床试验前，向药审中112、心提出沟通交流申请，对后续临床试验方案进行评估”等内容，申请人应特别关注。其他研发阶段，如有沟通交流的需求，可依据药物研发与技术审评沟通交流管理办法（试行）及其他相关文件提出沟通交流。符合一些具体情形的药物，可参照已发布的相关规定执行，例如：符合 I 类会议情形的儿童用药的沟通交流可参照儿童用药沟通交流中类会议申请及管理工作细则（试行）。儿童专用创新药、用于治疗罕见病的创新药以及纳入突破性治疗药物程序的创新药沟通交流可参照药审中心加快创新药上市许可申请审评工作规范（试行）等。（二）沟通交流的资料准备应根据药物研发及技术审评沟通交流管理办法的相关要求，在沟通交流申请表中填写药品基本信息以及研发情113、况。涉及临床试验方案的，应根据沟通交流会议资料以及临床试验方案提交与审评相关工作规范要求，基于适应症定位，提供详细、可操作的完整临床试验方案。由于细胞和基因治疗产品创新性强，研发进展快，如有其他相关资料，例如：本品既往沟通交流情况、本品其他适应症临床试验进展（或总结报告）、同适应症研究者发起临床研究进展（或总结报告）、同类产品研发情况、同类产品临床试验的进展或大会报道、37文献等，也可一并提供，供沟通交流中参考。细胞和基因治疗产品可能向多国（地区）监管机构同时申报注册，考虑到国内外受试者种族因素、国内外药品监管机构监管政策的差异、以及产品生产和供应等因素，与国外严格监管机构（Stringent114、RegulatoryAuthority，SRA）沟通交流的会议材料和纪要或记录也是与药审中心沟通交流的重要材料，鼓励一并提供。（三）沟通交流的问题沟通交流问题应明确、具体、有针对性，并简短地介绍问题背景、提供问题提出的目的、申请人观点及依据等。避免提出笼统的问题，例如：临床试验方案是否可行。针对临床试验方案主要设计要素的问题应提供相应的依据，例如：对于细胞和基因治疗产品 I 期临床试验的剂量选择是否合理的问题，除提供临床前研究相关数据外，同类产品临床试验中剂量也是重要参考依据。对于细胞和基因治疗产品多次给药的合理性，可根据产品特点，考虑免疫原性、药代动力学研究（例如：对基因治疗产品，包括脱落研115、究、生物分布研究、转基因产物的药代动力学研究）等内容，提供给药次数和间隔的依据。（四）沟通交流的学科如申请针对确证性临床试验方案的沟通交流，建议同时与临床专业和统计专业就临床试验设计和统计学假设等内容进行沟通。应对试验设计和统计假设提供详细、充分的依据。尤其是细胞和基因治疗产品治疗末线肿瘤或罕见病等适应症，可能采用外部对照的单臂临床试验设计，此时应提供历史治疗的高质量研究文献或流行病学调查等数据作为统计假设参数设置的依据。由于细胞和基因治疗产品生产工艺复杂，在临床试验过程中可能发生药学工艺的优化和变更。如果在确证性临床试验中发生重大药学变更，建议同时与药学专业、药理毒理学专业、临床专业、统计专116、业就药学变更可比性是否需要临床试验验证进行沟通交流。（五）多个适应症的沟通交流申请某些类型的细胞和基因治疗产品作用机制复杂，对同一靶点或发病机制类似的多种适应症均有潜在的获益。如果同一产品拟申请针对多种适应症临床试验的沟通交流，建议不同适应症分别提出沟通交流申请。（六）沟通交流的形式沟通交流形式的确定取决于如何更好地解决拟沟通交流问题，如果申请人的问题可以38通过书面反馈意见的形式解决，则不再召开面对面/视频/电话等形式的沟通交流会议。四、示例通过示例，旨在梳理如何基于问题发起沟通交流。品种基本情况：品种基本情况：某溶瘤病毒，是以血清型 X 型腺病毒骨架为基础进行改造的条件复制型重组溶瘤腺病毒117、。药学背景资料：药学背景资料：用肿瘤特异性表达基因启动子取代了原腺病毒启动子使其在肿瘤细胞中选择性复制；改造原腺病毒骨架蛋白，构建以 X 型血清型腺病毒为主的嵌合载体，以降低免疫原性、提高腺病毒对肿瘤细胞感染效力、促进在正常细胞中的清除、减少肝毒性等；增加细胞因子等基因表达框，发挥协同抗肿瘤效能。非临床背景资料：非临床背景资料：体内、外药效学研究、药代动力学研究、毒理学研究等。沟通交流申请阶段：沟通交流申请阶段：申请临床试验前拟沟通交流的学科：拟沟通交流的学科：临床专业申请人提交资料：申请人提交资料：沟通交流会议申请表、沟通交流会议资料、沟通交流会议 PPT、临床研发计划和早期探索性临床试验方118、案、风险管理计划、临床综述、药学综述、非临床综述等资料。拟沟通交流问题之一：拟沟通交流问题之一：DLT 定义是否合理？申请人观点：申请人观点：申请人参照同类产品的 DLT 定义，为本品制定了相同的 DLT 定义。CDE 观点：CDE 观点：虽然同类产品的 DLT 定义可作为拟开展临床研究的参考之一，但是，DLT 定义建议从产品自身设计出发，综合考虑产品特点，科学制定。建议关注：（1）产品自身特点。与同类产品相比，病毒载体存在差异。参考的同类产品采用了血清型 Y 型腺病毒载体，而本品则采用了基因改造-嵌合载体型腺病毒载体。由于嵌合的其他血清型载体的研究应用较少，可能需针对该改构做尽可能全面的调研119、，考虑不同的病毒载体可能存在的安全性风险的差异，在 DLT 定义中纳入载体相关风险的安全性观察指标。本品在溶瘤病毒载体上插入某细胞因子等基因，细胞被感染后将表达分泌该细胞因子，还需关注相关不良反应。（2）非临床研究动物毒理学试验中发现，研究动物出现了供试品相关的急性肝、肾功能受损并导致动物死亡，原 DLT 定义中未见针对肾毒性的内容，建议完善。（3）DLT 观察期。参考同类产品观察期，设置了本品 DLT 观察期为 28 天，但是非39临床研究结果显示，不良反应可持续到41天，则需结合非临床研究中相关毒性反应的发生、持续、缓解时间，合理设置 DLT 观察期。从本示例可见，申请人提交的资料比较全面120、，但是未能基于自身品种特点、前期研究数据等明确临床试验关键因素，需要特别关注。五、参考文献 1.国家药品监督管理局药品审评中心，2020，药物研发与技术审评沟通交流管理办法2.国家药品监督管理局药品审评中心，2023，药物临床试验方案提交与审评工作规范3.国家药品监督管理局，2020，药品上市许可优先审评审批工作程序（试行）4.国家药品监督管理局药品审评中心，2023，药审中心加快创新药上市许可申请审评工作规范（试行）5.国家卫生计生委、国家食品药品监管总局，2015，干细胞临床研究管理办法（试行）6.国家药品监督管理局药品审评中心，2023，人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原121、则（试行）7.国家药品监督管理局药品审评中心，2021，免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）8.国家药品监督管理局药品审评中心，2021，溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则（试行）9.国家药品监督管理局药品审评中心，2023，基因治疗血友病临床试验设计技术指导原则10.国家药品监督管理局药品审评中心，2021，基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）40六、附件细胞和基因治疗产品临床相关沟通交流资料的说明1.“+”指必须提交的资料。2.“-”指不必提交的资料。3.“”指可以提交的资料。4.“#”指在既往提交的基础上，提交更新、完善后的资料，并提交修订历史和说明（针对临床研发计划122、，临床试验方案，风险管理计划）。5.“”指提交简要内容。41基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）2021 年 11 月42一、前言（一）背景随着基因转导和修饰技术、递送载体系统、细胞培养技术等领域在基础研究和技术开发上的快速发展，基因治疗取得了突破性进展，为难治性疾病（尤其是罕见遗传性疾病）提供了全新的治疗理念和思路。自基因治疗技术出现以来，安全性始终是基因治疗研发最为关注的问题之一，关系到整个领域技术研发和产业应用的健康有序发展。基因治疗产品（Gene.Therapy.Products）应开展系统的非临床研究，评估安全性风险，验证有效性机制，以支持开展相应临床试验及上市。基因治疗123、产品种类多样，作用机制和起效方式均有别于小分子、大分子药物，非临床试验设计、实施以及研究设计中试验类型、时间安排和灵活性，可能与其它药物的非临床研究不同。（二）目的本指导原则为基因治疗产品研发提供建议，以帮助设计合适的非临床研究计划，并作为非临床评价的参考，以支持开展相应的临床试验。基因治疗产品非临床研究为临床试验提供支持性信息，研究内容一般为药理学、药代动力学、毒理学，用于提供作用机制有效性证据、明确生物分布特点、确定药理作用特征、了解毒理学特征（确定靶器官、暴露量-反应关系和可逆性等）、确定首次人体试验的安全剂量水平、建议临床给药途径和剂量递增计划、支持患者入组标准、确定可指导临床监测的生124、理参数、提示临床试验风险等。本指导原则旨在促进基因治疗产品的研发，并保护受试者免受不必要的不良反应，同时遵循“替代、减少、优化”的 3R 原则(Replacement,.Reduction,.Refinement,.“3Rs”)，以避免不必要的动物及其它资源的使用。适当情况下，基因治疗产品研发中应考虑其他非临床研究指导原则的建议。本指导原则主要描述了与其他指导原则的非临床试验建议不一致的特殊情况。（三）一般原则源于对基因治疗产品多样性、生物体复杂性和科学认知局限性的考虑，基因治疗产品研发应遵循创新药物研发的一般原则，分阶段逐步推进。基因治疗产品非临床研究应为临床试验风险-获益分析提供充分的信息125、。由于基因治疗产品种类、作用机制、作用特点、给药途径、安全性风险等方面的差异，应基于风险分析设计并开展非临床研究，综合评估临床试验受试者潜在风险-获益。由于基因治疗产品的生物学复杂性，基因治疗产品非临床研究和评价均应采取具体问43题具体分析的原则，综合考虑产品导入基因（Transgene）特性、载体生物学特征、研究模型的可行性/可获得性、适应症/目标患者群体、给药途径、给药方案等多种因素。基因治疗产品非临床安全性研究一般应当在经过药物非临床研究质量管理规范（GLP）认证的机构开展，并遵守药物非临床研究质量管理规范。对于某些采用特殊动物模型、药理毒理整合性研究、特殊指标检测等非常规试验内容，可以126、考虑在非.GLP.条件下进行，但应保证数据的质量和完整性。（四）范围基因治疗产品通过转导的遗传物质的转录或翻译而发挥作用，一般包括：核酸（例如质粒、RNA）、表达特定基因的基因修饰微生物（例如病毒、细菌、真菌）、离体基因修饰的人类细胞，以及体内编辑宿主基因组（通过或未通过特定的转录/翻译）的产品和未通过基因修饰表达特定基因的微生物（例如溶瘤病毒产品）。本指导原则适用于除基因修饰细胞以外的基因治疗产品，不适用于化学合成的寡核苷酸及其类似物、预防性疫苗。基因修饰细胞治疗产品参见基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则。二、非临床研究基因治疗产品的非临床研究应在相关动物种属中开展。一般认为，127、基因治疗产品应能在相关动物种属中有效导入/暴露，有效转录/翻译，发挥药理学活性作用。复制型载体的基因治疗产品应可在相关动物种属中复制。相关动物种属选择应综合考虑生物学反应性和疾病特点，可以选择野生型、免疫缺陷型、人源化或其它基因修饰的动物。考虑基因治疗产品特殊性和临床适应症，某些情况下可能需要采用非常规的动物种属和品系开展非临床试验，如基因修饰啮齿类动物（例如转基因或基因敲除）、其它啮齿类动物（例如叙利亚仓鼠、棉鼠等）、以及非啮齿类动物（例如绵羊、猪、山羊、马等）。采用非常规的动物种属和品系需提供科学依据。基因治疗产品非临床研究中所用受试物应明确其特性，应该能够充分代表临床试验拟用样品，还应考128、虑生产过程、重要质量特征（例如滴度）、临床拟用剂型等因素。如果基因治疗产品生物学作用具有种属特异性，应考察评估受试物在非临床研究中的活性，科学论证其对临床拟用样品的代表性。当产品药学信息（载体结构、表达元件、生产工艺等）发生重大变更时，需要评估开展桥接研究或新的非临床研究的必要性。（一）药理学44基因治疗产品药理学研究是为了在体内、体外研究产品与治疗靶点相关的作用机制和效应，明确基因治疗产品的生物学作用特点，应选择合适的体内或体外模型进行，并以此评价基因治疗产品在人体中潜在治疗作用和效果，有助于后续非临床和临床试验的剂量选择。在某些情况下，相关人用经验可能有助于加深对基因治疗产品生物学作用特征129、的认识。在开展临床试验之前，基因治疗产品应当完成作用机制、量效关系特点和药效活性的支持性研究。1.动物模型动物疾病/损伤模型可能相对正常健康动物模型更加适于评价“风险-获益”关系，更有机会发现可以用于临床试验监测的活性/毒性生物标志物。选择动物模型时应考虑以下因素：受试物在动物模型中复制能力和转导（转染、感染）特性；动物模型中与受试物相关的细胞/受体表达和组织分布；受试物中生物调节活性的组分对动物模型转基因的表达水平和组织表达特异性的影响；受试物导入基因产物引起的生物学效应；动物预存免疫学状态对受试物的影响；动物模型内在的与导入基因同源的基因及其产物对药效的影响；转基因动物用于特定受试物药效评130、价的适用性；动物模型实际可行的安全剂量和体积；受试物在动物模型中的生物分布特征等。在选择动物疾病/损伤模型时需要考虑其局限性，包括模型内在的固有变异、历史/基线数据不足、生理功能和解剖结构的技术性限制、模拟人体疾病/损伤病理过程的可靠性等。如果没有合适的动物模型满足试验需要，应当依据科学原理开发相应的动物模型或使用更完善的体外试验系统、替代性模型（例如类器官）开展试验。需要科学论证新的动物模型、体外试验系统或替代模型试验对临床试验设计的支持性。如果单个动物试验模型不足以论证相关问题，则应采用多种动物模型开展相应研究，进行综合分析评价。2.概念验证研究基因治疗产品生物学作用与实验系统、实验动物种131、属高度相关，在基因治疗产品药理学研究中应关注概念验证（Proof.of.Concept,.POC）研究的重要性。POC.研究为临床试验提供可行性和有效性的非临床证据，并提供可能的生物学作用机制、潜在的安全性问题等信息。POC.研究的目标包括：1.确定基因治疗产品的有效剂量范围，包括最低起效剂量，推荐开展量效关系的探索性研究；2.优化给药途径，以确保治疗产品能到达靶组织、器官或特定细胞类型；3.优化给药方案，包括相对疾病进展的最优给药时间；4.验证基因治疗产品的生物学功能及作用机制。45POC.研究包括体外研究和体内研究。体外研究主要用于评价基因治疗产品的生物学功能（如治疗基因的作用、表达产物的132、活性、特定细胞功能的恢复等）和对作用机制的初步验证。单独的体外研究通常不足以预测基因治疗产品在人体内的药理及毒理学特征，因此需要选择合适的动物疾病模型进行体内研究，通过对动物表型、导入基因的体内表达及其功能活性相关的生物标志物等进行检测以说明基因治疗产品的有效性和/或安全性。由于种属和免疫状态的差异，基因治疗产品在人体内的表达、分布和作用与在模型动物中可能有较大不同，可选用替代产品（如治疗基因使用来自模型动物的同源基因，或使用基因修饰的模型动物细胞、组织和类器官等）进行.POC 研究。应详细说明采用替代产品的试验设计，并科学评估替代产品体内研究数据对临床试验的支持性。3.安全药理学基因治疗产品133、（包括载体和导入基因，以及导入基因的表达产物）安全药理学主要是研究受试物在治疗剂量范围内或治疗范围以上剂量时，对生理功能潜在的非期望作用，一般包括对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统的影响，通常应在临床试验前完成。采用基于风险的评价策略开展基因治疗产品的安全药理学试验，考虑因素一般包括：导入基因作用机制、载体类型、生物分布、给药途径和临床给药方案等。安全药理学试验通常采用单次给药方式，其研究终点也可以纳入到一般毒理学试验中。（二）药代动力学1.暴露量基因治疗产品应根据产品具体特点考虑非临床研究中的实际暴露情况，对非临床（药理学、药代动力学、毒理学）研究结果进行分析评价。2.生物分布基因治疗产品134、生物分布是受试物在相关动物种属中给药部位、靶组织和非靶组织包括体液（例如血液、脑脊液、玻璃体液）在内的体内分布、存续和清除。生物分布特征是基因治疗产品非临床研究的关键部分，有助于解释药理学、毒理学的研究发现，也为临床试验设计提供支持信息。基因治疗产品生物分布研究应在临床试验开始前完成。基因治疗产品生物分布研究应采用足够的剂量，以临床拟用的给药途径，在相关动物种属或动物模型中开展，不仅包括导入基因的检测，还可能包括导入基因表达产物、载体的检测。采样时间点的安排应能体现基因治疗产品体内过程的特点，至少包括在靶组织和非靶组织的峰值和稳态阶段。具有体内复制特征的基因治疗产品，采样点至少包括第一、46第135、二两个峰值和清除阶段。生物分布研究的检测方法应经过方法学验证。基因治疗产品在分析非临床生物分布研究结果与临床相关性时，应关注给药途径、剂量水平、给药方案和实验动物的免疫反应等因素。3.脱落脱落是指基因治疗产品通过排泄物（尿液、粪便）、分泌物（唾液、鼻咽液等）或皮肤（脓疱、疮、伤口）排出体外。根据基因治疗产品的特点（例如复制型基因治疗产品）评估开展脱落分析的必要性。除相关的核酸检测外，脱落分析还应根据具体产品的特点考虑排出体外成分的感染能力。根据基因治疗产品脱落的特点和感染风险，在临床试验中采取相应的风险控制措施。（三）毒理学在毒理学研究中，应对基因治疗产品进行全面的安全性分析评价，必要时还应评136、价导入基因的表达产物的安全性。由于基因治疗产品的生物学复杂性，毒理学试验设计应综合考虑产品本身的特点（如导入基因结构和作用机理、表达产物的表达水平与活性、载体性质和生物学特征、相关动物种属和疾病模型的可获得性）和临床应用（如适应症、给药途径和给药方案等）。原则上应选择可以代表临床使用的给药途径和方法，采用具备合适的剂量范围，还应注意组别、检测指标和时间节点的合理性。必要时，可考虑增加额外的组别（例如静脉给药，以评价潜在的严重毒性反应）、额外的检测时间点、特殊的毒性生物标志物检测等。当采用临床拟用样品的毒理学试验难以提供有价值的信息时，也可考虑采用替代产品开展毒理学试验，但需提供科学依据，并应注137、意替代产品和临床拟用样品之间，在生产工艺、杂质/污染物水平、药代动力学以及确切的药理学机制方面都可能存在差异。使用替代物产品的试验可以用于风险识别，以及了解放大的药理作用的潜在不良影响，但是一般不用于定量风险评估。1.一般毒理学一般毒理学试验用以评价基因治疗产品毒性特征、毒性可逆性、剂量-毒性反应关系、生物分布-毒性反应关系等，包括单次给药和重复给药毒性试验。一般毒理学试验设计时应关注动物种属的选择、与基因治疗产品特性相关的检测指标、毒性反应的持续时间和可逆性。（1）动物种属选择47毒理学研究中所选动物种属应与基因治疗产品具有良好的生物学相关性，采用相关动物种属开展试验。通常情况下，毒理学试验138、采用正常健康动物，某些情况下亦可参考药理学试验中使用的疾病动物模型以预测临床试验风险/获益比。如果选择单一性别或特定年龄阶段的动物开展试验，需要提供科学合理性依据。至少采用一种相关动物种属开展一般毒理学试验。必要时，考虑开展更多动物种属的一般毒理学试验。（2）剂量设计通常情况下，一般毒理学试验中的给药剂量应该包括在最合适的非临床药效模型中确定的药效剂量范围或拟推荐的临床剂量范围。最高剂量一般期望获得明显毒性反应的相关信息，通常为药效学最高剂量的一定倍数或拟推荐临床最高剂量的一定倍数。最高剂量的设置可能会受到动物模型、递送靶组织的容量/大小、给药途径、产品的生产能力和高浓度制剂稳定性等限制。如果139、受载体浓度或给药体积的限制，可选择最大可行剂量作为最高剂量。最大可行剂量一般考虑可配制的产品浓度和可输送至靶组织/器官的体积及其载量。（3）分组一般毒理学试验原则上应设低、中、高.3个剂量组，以及合适的对照组，例如溶媒、辅料、空载体、含有非功能转基因的载体等对照组。当使用疾病动物模型作为试验系统时，应考虑设计模型对照组、假手术组等。（4）给药方案在一般毒理学试验中，基因治疗产品的给药方案应最大程度地模拟临床拟用给药方案，给药途径、给药频率和给药期限应能适当反映临床使用情况。对于临床研究拟单次给药的基因治疗产品，可开展扩展的单次给药或重复给药毒性试验。基因治疗产品应考虑延长合适时间进行给药后毒性140、指标的检测。针对具有长期表达特性的基因治疗产品，毒性观测指标检测时间应延长至暴露量稳态之后，且足以评价毒性反应持续时间和可逆性。如果基因治疗产品拟在人体中长期发挥作用，但实际在动物中作用时间明显短于人体，或者复制型产品在动物体内的复制动力学特征无法反映其在人体中的情况，此时应考虑进行重复给药毒性试验以模拟人体情况。对于临床研究拟多次给药的基因治疗产品，应进行重复给药毒性试验，给药次数和给药频率一般不应低于临床给药次数和频率。多次给药间隔时间应根据基因治疗产品的作用特点（如载体发挥作用持续性、导入基因表达的相关信息等。这些信息可以来自概念验证试验和/或已有的相关文献资料。）进行设计，以保证能够充141、分暴露毒性风险。48（5）试验期限基因治疗产品一般毒理学试验的持续时间通常会长于其它生物制品的标准毒性试验持续时间。在设计一般毒理学试验时，需阐述试验期限的合理性，并根据基因治疗产品的作用特点（如载体发挥作用持续性、导入基因表达的相关信息等），确定恢复期观察时长。一般毒理学试验应包括多个解剖时间点（至少应包括导入基因峰值时间点、稳态时间点等），以便评价基因治疗产品发挥作用的持续性，以及剂量/暴露量与毒性反应、生物分布与毒性反应的关系。（6）检测指标除常规观察指标外，一般毒理学试验需结合基因治疗产品特性，考虑增加合适的观察指标，如生物活性细胞因子分泌、异常/异位增生性病变、免疫原性/免疫毒性等。142、应考察基因治疗产品中载体和导入基因在体内的转录/翻译、分布、存续情况，为毒性试验的结果解释提供支持性数据（必要时设置卫星组）。必要时还应考虑基因治疗产品中脱落的可能性及生殖毒性风险。2.免疫原性和免疫毒性基因治疗产品可能导致的免疫反应包括先天性免疫反应和适应性免疫反应。多种因素可显著影响基因治疗产品的先天性和适应性免疫反应，如宿主因素（前期接触过相关病毒血清型和/或导入基因产物、免疫系统状态）、基因递送方式（递送系统种类、给药途径和靶组织）、载体（载体种类、血清型、剂量和导入基因的调控元件类型等）、导入基因的产物、异位表达基因产物（特别是针对免疫豁免器官和/或部位特异表达的基因产物）。基因治疗143、产品的免疫原性可能来源于产品中的非人源化组分、导入基因的表达产物、载体、基因编辑产生的非预期的肽/蛋白质等。病毒载体类基因治疗产品相对更容易产生免疫原性。此外，还应考虑实验动物预存免疫对试验的影响。根据基因治疗产品的质量研究，如果预计会产生异常基因产物，或基因治疗产品表达的蛋白质与天然产物相比结构发生了改变，则应进一步评估表达产物的免疫原性。如果基因治疗产品可导致补体激活，则应考察血清中补体激活标志物。已知对免疫系统有影响的基因治疗产品，如编码生长因子、细胞因子等的产品，通常需要开展免疫毒性研究，应包括体液和/或细胞免疫终点评价。对于某些特定的基因治疗产品，动物模型可能无法代表临床实际情况，因144、此可能无法提供可解释的免疫毒性数据。在这些特定情况下，建议采用动物模型的同源基因序列开展试验，以提供相关支持性信息。493.生殖毒性基因治疗产品应根据受试物的产品类型、作用机制、一般毒理发现、生物分布特征以及患者人群来评估潜在的生殖/发育毒性风险。生殖毒性试验的研究策略和风险评估可参考.ICH.S5（R3）的建议和.ICH.M3（R2）、S6.及.S9.中的相关内容。通常需要开展胚胎-胎仔发育毒性和围产期毒性研究，除非有基于具体产品类型的特殊考虑并具有科学合理性。如果基因治疗产品拟用于有生育可能或妊娠人群，应研究产品对胎儿的影响（例如细胞因子局部生成后通过胎盘转运），开展胚胎-胎仔发育和围产期145、毒性试验。如果在一般毒理学试验中发现有潜在的生殖器官毒性反应，应开展生育力和早期胚胎发育毒性试验。当基因治疗产品在生殖器官持续存在时，需要进一步研究确定其在生殖细胞（例如卵母细胞、精子）的暴露水平。根据载体类型、复制能力、基因组整合特性、剂量水平、给药途径等因素，分析评估基因治疗产品生殖系整合风险。4.遗传毒性基因治疗产品将遗传物质转移到宿主细胞内或整合到宿主基因组中或对宿主基因组进行编辑，存在潜在的遗传毒性风险。目前对于判断细胞基因组插入/修饰是否会产生遗传毒性、是否最终会发生癌变依然还缺乏系统的认知，因此，需要分析基因组改变（载体或遗传物质整合进基因组、对基因组编辑等）的特征，并评估相关潜146、在风险。通常不需要进行标准的遗传毒性组合试验，但应根据基因治疗产品的特点、产品的具体适应症、载体的已有信息、导入基因序列结构等，评估基因治疗产品整合进基因组的可能性，判断是否需要开展另外的遗传毒性研究，如研究基因组修饰的发生情况，并检测随后可能发生的异常细胞行为；评估插入突变（插入位点、插入拷贝数等）引起的遗传毒性风险。当基因治疗产品采用基因编辑或转座子技术时，需要关注脱靶编辑、转座子转座印迹引起的遗传毒性问题；鉴定/表征基因组整合位点。遗传毒性需要考虑最终产品的形式、给药途径（全身或局部）以及靶向的具体组织/器官/细胞的生物学状态等。如果目标细胞是未分化细胞，插入突变产生遗传毒性的风险相对较147、高。基因修饰噬菌体、细菌和真菌相关的产品可以不进行遗传毒性研究，一般认为这些产品通常不会直接与宿主细胞基因组发生相互作用。5.致癌性标准的啮齿类动物致癌性试验一般不适用于评价基因治疗产品。可采用证据权重（Weight.of.Evident,.WoE）方法来评估致癌性风险，必要时进行致癌性研究。WoE 关注因50素一般包括但不限于：药物靶点和药理作用通路已知与致癌性相关（例如导入基因产物是生长因子）；靶点和信号通路的药理作用特征预测与肿瘤发生发展有一定相关性；插入突变研究的相关结果提示有致癌性风险；载体设计中有潜在致癌风险；生产体系中存在引入致癌成分；一般毒理学试验组织病理学发现，包括弥漫性和/148、或局灶性细胞增生、持续的组织损伤和/或慢性炎症、癌前病变和肿瘤发生；激素紊乱；免疫抑制；其他技术方法研究发现与动物和/或人体内肿瘤发生相关。6.复制型病毒风险采用复制缺陷病毒载体的基因治疗产品，需要评估在生产的过程中是否有可能产生复制型病毒。如果基因治疗产品可能含有翻译病毒结构或非结构蛋白的元件，应充分评估该产品在体内产生活性完整病毒颗粒的风险。应根据基因治疗产品具体特点，评估分析因基因突变和内源性病毒片段重组产生复制型病毒的可能性。检测复制型病毒的技术方法应通过方法学验证。如果基因治疗产品有可能产生复制型病毒，应采用动物/细胞模型对复制型病毒风险进行评估。在评估复制型病毒风险时，应考虑到该病149、毒在不同物种之间的流行性以及传播性。针对动物/细胞试验的结果是否能够反映在人类传播的流行病学原理需要进行慎重评估。7.局部耐受性根据产品类型、给药途径和临床试验方案，某些基因治疗产品（例如眼内给药、肌肉注射、瘤内给药等）应开展局部耐受性试验，适当时可以结合在一般毒理学试验中进行。三、支持临床试验的非临床考虑（一）首次临床试验起始剂量确保受试者安全是考虑和确定基因治疗产品首次临床试验起始剂量的出发点。首次临床试验起始剂量应根据非临床研究所提示的安全有效性特征，采用所有已有的非临床数据（药代动力学、药理学和毒理学）进行科学论证，并且基于多种方法进行选择。如果未见经典的量效关系，那么最低起效剂量（M150、inimal.Effective.Dose）和最高耐受剂量（Maximum.Tolerable.Dose）可能可以为剂量/暴露量与活性/毒性的关系提供有用的信息。应根据具体基因治疗产品生物学作用特点，选择合适的方式进行动物剂量与人体等效剂量的种属间换算。体表面积标准化、体重等比放大、靶器官体积或重量比例放大等可能是合适的方式。此外，还考虑基因治疗产品在不同种属靶器官的生物分布差异。不同类型的基因治疗产品，可能需要采用不同的策略来拟定首次临床试验起始剂量。51（二）关键非临床研究非临床研究信息应能充分支持临床试验剂量、方案并确定潜在的毒性。应科学论证基因治疗产品非临床研究对临床试验的支持性，综合151、评价具体临床试验方案的风险-获益。一般情况下，基因治疗产品非临床研究项目和阶段性评价策略可参考.ICH.M3（R2），但应根据基因治疗产品的具体特点、适应症、用药人群，具体问题具体分析，综合评价非临床研究对临床试验方案的支持性。对于拟用于晚期肿瘤患者的基因治疗产品，非临床研究项目和阶段性评价策略可参考.ICH.S9。基因治疗产品应尽早完成生物分布研究，以了解基因治疗产品在体内分布、存续和清除的特点，选择合适的动物种属，开展合适的药理学、毒理学研究，并设计合理的临床试验方案。在临床试验开始前，应在作用机制、有效剂量范围、量效关系、耐受剂量、毒性反应特征、种属差异、给药途径/方案等方面完成科学论证152、。考虑到基因治疗产品的特殊性，在合适的情况下，其药理学、药代动力学、毒理学试验也可考虑联合开展。52基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）国家药品监督管理局药品审评中心2021 年 12 月53一、概述（一）前言基因治疗是指通过修饰或操纵基因的表达以改变活细胞的生物学特性，从而达到治疗目的的治疗手段，主要作用机制有正常基因替换致病基因、使不能正常工作的基因失活或者引入新的或修饰的基因等方式。随着基因治疗技术的不断发展，临床研究的不断深入，基因治疗已为多种难治性疾病提供了新的治疗策略。目前，在全球范围内已有多个基因治疗产品批准上市，如，AAV2-hRPE65v2.用于治疗.RPE65 153、基因突变造成的视网膜营养不良，CAR-T.细胞用于治疗多种恶性血液肿瘤以及含人.ADA.cDNA.序列的逆转录病毒载体转导的.CD34+细胞用于治疗腺苷脱氨酶缺乏导致的重症联合免疫缺陷。国内也有治疗不同适应症的多种基因治疗产品进入临床研究阶段。通常来说，基因治疗通过引起人体的永久或长期的变化达到治疗效果，这些变化在体内长期存在，可能增加不可预测的风险如迟发性不良反应等。为了评估和降低迟发性不良反应等风险，并了解治疗效果随时间延长的变化，有必要对接受基因治疗临床试验的受试者开展长期随访。长期随访的观察方法和研究设计取决于基因治疗产品的风险特性、适用人群和给药途径等因素，本指导原则主要针对上述因素154、开展讨论，对于药物临床试验需要遵从的一般原则以及与其他指导原则的重复内容在本指导原则中不再赘述。（二）目的和适用范围本指导原则适用于按照中华人民共和国药品管理法、药品注册管理办法等药品管理相关法规进行研发和注册申报的具备基因治疗属性的产品，如质粒.DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞以及基于基因编辑技术的产品等，旨在为该类产品开展长期随访临床研究提供技术指导，确保及时收集迟发性不良反应的信号，识别并降低这类风险，同时获取这类产品长期安全性和有效性的信息。本指导原则是对基因治疗产品开展长期随访临床研究相关技术问题的建议和推荐，不具有强制性的法律约束力。随着基因治疗技术的发展、认知深入和经验155、积累，本指导原则中的相关内容将不断完善与更新。申请人在研究中应始终坚持具体问题具体分析的原则，并建议及时与药审中心就长期随访研究方案的具体设计和细节进行沟通。54二、基因治疗产品长期随访临床研究设计（一）长期随访的观察目的基因治疗产品长期随访的主要目的是收集受试者的迟发性不良反应，了解基因治疗产品在体内的存续情况，从而识别并降低接受基因治疗产品的患者的长期风险。此外，考虑到基因治疗产品长期作用的特点，观察疗效随时间的变化情况也是长期随访的目的之一，有助于评价产品的获益风险情况。（二）长期随访观察的考虑要素1.迟发性不良反应相关的潜在风险因素在评估基因治疗产品的风险因素时，申请人应考虑基因治疗产156、品的特性，同时参考该产品的非临床和临床数据以及类似产品的已知数据。基因治疗产品的非临床研究旨在为临床研究提供支持性信息和关键安全性特征参数，如机体中的生物分布和持久性.、整合/修饰宿主基因组、潜伏再激活以及潜在免疫原性等。对于新型基因治疗产品，可参考数据有限，申请人应尽可能在非临床研究中获得用于评估迟发性不良反应风险的数据。基因治疗产品特有的可能会引起迟发性不良反应的风险因素包括：（1）基因组整合活性基因治疗产品可能会采用修饰宿主基因组的技术，并有可能在宿主细胞或组织中持续存在。很多基因治疗载体的基因整合不会指向基因组的特定位点，可能在整合位点处产生插入突变、或激活整合位点附近的原癌基因等，进157、而破坏重要基因功能或增加恶性肿瘤的风险，例如，国外已有多项研究报告在接受了使用.-逆转录病毒载体转导的基因修饰细胞治疗的受试者中发生白血病。因此，对于存在此类风险的产品，有必要进行长期随访临床研究以评估出现迟发不良反应的风险。国内外基因治疗产品开展的非临床研究、长期随访获得的临床经验以及基因组整合位点分析方法的显著改进，都有助于更好地理解整合性基因治疗载体相关风险。通常认为，很多能够介导外源基因转入细胞核的载体（如逆转录病毒载体、转座子元件和基因编辑产品等）有基因组整合潜力，需要通过长期随访观察迟发性不良反应的风险；根据目前的认识和研究数据，质粒、痘病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）等载体的基158、因治疗产品整合风险较低，国际上开展的临床试验中也表现出较低的迟发性不良反应风险。当载体或基因治疗产品原有的风险特征增加时，例如经过修饰以携带基因组编辑成分的质粒或改变给药方式以提高整合能力等，需要提高对长期随访观察的要求；反之，也可以对目前认为存在迟发风险的基因治疗载体进行修饰，以降低这些风险。55（2）长期表达与其他产品相比，部分基因治疗产品的显著特征是可以在患者靶细胞或基因修饰细胞中持续存在并编码表达作用因子（功能性蛋白或基因表达调节元件），并通过永久或长期改变靶细胞或组织的功能来达到治疗效果。同时，由于基因治疗编码的作用因子在体内的长期暴露或表达异常，可能产生与其功能相关的长期安全性风险159、，如细胞生长失控和恶性肿瘤形成、自身免疫反应或其他无法预测的迟发性不良反应。（3）潜伏再激活部分病毒类基因治疗产品可能存在从潜伏期被再激活的可能性或者引起机体中已有病毒感染的再激活，存在感染相关的迟发性不良反应的风险。（4）持续感染有复制能力的病毒或细菌载体基因治疗产品，有可能在免疫能力低下的患者中发展为持续感染，进一步增加发生迟发但严重感染的风险。（5）基因编辑活性基因编辑等新型基因治疗产品有独特的基因组修饰功能，可诱导人类基因组中的位点特异性改变或修饰，同时也可能在基因组中发生脱靶效应，导致非预期的基因表达变化，进而增加未知且不可预测的迟发性不良反应风险。（6）非预期的生物分布某些基因治疗160、产品需要在特定的细胞或组织中表达以实现治疗目的，如果基因治疗产品在非预期的细胞、组织或器官中表达或修饰，可能引起非靶细胞功能、生长或/分化改变，甚至引发肿瘤。（7）基因重排或重组当基因治疗产品所用载体及其携带的基因发生复制时，可能出现非治疗目的非预期的基因表达或改变，或者与相应野生型或辅助病毒互补后产生回复突变或意外复制或形成新的病毒。（8）免疫原性 由于基因治疗产品在体内的持续暴露或者需要多次给药等情况，机体可能产生针对基56因治疗载体或编码的作用因子的免疫应答。由于基因治疗产品在靶细胞或组织中的表达时间、分布范围或表达强度等差异，机体免疫应答的后果可能从不具有临床意义的一过性的免疫反应，到161、针对靶细胞或组织的免疫攻击，甚至产生严重危及生命的不良事件。（9）脱落与传播对于部分有感染或复制能力的基因治疗产品，从受试者者体内排出或脱落到自然环境后，可能会传播给受试者的密切接触者，包括患者亲属和医护人员等，进而产生病毒传播或感染风险。（10）其他考虑因素除产品相关因素外，基因治疗产品的长期风险评估还应考虑靶细胞/组织/器官，患者群体（年龄、免疫状态、死亡风险等）和相关疾病的特征以及合并其他治疗的影响。如果基因治疗产品可在生殖腺、生殖细胞等组织器官中分布并发挥作用，可能对受试者或其配偶的生育能力、妊娠以及胎儿产生难以预测的迟发性影响。2.临床研究人群如果一种基因治疗产品具有引起迟发性不良反162、应的风险，需要开展长期随访观察时，所有接受基因治疗产品的受试者在签署知情同意书后均应入组长期随访临床研究。在设计长期随访临床研究的方案时，应考虑目标受试者人群及特征、整体健康情况以及接受治疗的患者的预期生存期等特征对迟发性不良反应的收集的影响。通常来说，当临床研究人群的某些特征（如预期寿命短、多重合并症、以及暴露于放疗或化疗等其他药物）可能干扰迟发性不良反应的观察分析时，会影响长期随访观察在评估和减轻受试者风险方面的效用；而在病情较轻或较局限，合并症以及伴随治疗有限或较稳定的受试者中，通过长期随访观察收集到的评估数据可能更容易分析。3.长期随访的观察时间长期随访的持续时间应确保足以观察到受试者163、因产品特性、暴露情况（生物分布和给药途径）等导致的风险，应不短于迟发性不良反应的预期发生时间。一般而言，针对不同类型的基因治疗产品建议如下：具有基因组整合活性的载体（例如.-逆转录病毒和慢病毒载体）和转座子元件建议观察不短于.15.年。.可以产生持续感染、或有潜伏再激活风险的细菌或病毒载体（如单纯疱疹病毒）建议观察.15.年或至数据表明不再存在任何风险（感染或再激活）。57基因编辑产品建议观察.15 年或至数据表明不再存在任何风险。.腺相关病毒载体建议观察.5.年或至数据表明不再存在任何风险。以上长期随访时间的建议主要基于基因治疗的产品类型，具体产品的随访时间取决于产品的特性和体内存在时间、转164、基因表达时间、迟发性不良反应的预期时间及发生率、受试者适应症和预期生存期、给药途径、以及长期随访的其他观察目的。随着随访数据的积累，研究者和研究申办方可能会根据产品的存在情况、转基因表达和临床表现的持续评估情况，延长或缩短长期随访的持续时间。如果研究申办方认为其基因治疗产品安全性风险较低、无需开展长期随访临床研究，或者希望变更随访时间，应合理说明依据或变更理由并与药品监督管理部门进行沟通。4.有效性尽管基因治疗产品的疗效持续时间通常较长，但随着时间的推移，基于质粒、非病毒载体或病毒载体等的基因治疗产品在体内的转基因表达水平可能逐渐下降，含有载体或病毒的靶细胞数量也可能逐渐减少，上述因素都可能导165、致基因治疗产品的疗效逐渐下降。长期随访观察有助于了解基因治疗产品有效性随时间推移的变化情况，以及如果可能，再次接受治疗的时机和方法。（三）长期随访的设计实施1.知情同意知情同意应遵循药物临床试验质量管理规范的相关要求，向受试者说明参加临床试验可能预见的安全性风险，内容需包含长期随访研究的目的、研究程序、持续时间、访视间隔以及研究者、伦理委员会或申办方的联系方式等。当非临床研究或临床试验中发现基因治疗产品的风险有所改变时，应及时更新知情同意书并告知受试者。知情同意书中还应对长期随访期间的人体组织样本采集和保存、基因检测等进行说明。2.设计和实施在基因治疗产品长期随访临床研究中，应建立一套可行的监166、测计划用于记录并收集受试者与研究相关的所有数据，可以及时记录、报告不良事件并做出评估。通常，长期随访临床研究应详细说明受试者的监测计划，包括访视时间表、采样计划、监测检查方法以及长期随访临床研究中的目标临床事件等。建议申办方提供一份简明科学的随访记录指导，供研究者及相关医务人员（包括研究者以外的医生和护士）记录所有观察结果和与研究相关的所有数据。如果在临床试验期间或上市后获得改变基因治疗产品风险的重要信息，应58及时修订随访计划并予以实施。在受试者接受基因治疗后的.5.年内（或根据具体产品的风险确定的长期随访期内），临床随访应记录受试者的简要病史，使用致癌或致突变药物和其他药物的情况以及有关的167、不良事件信息，新出现、复发或加重的疾病（例如恶性肿瘤、神经系统疾病、免疫原性或自身免疫类疾病、感染、甚至死亡等）及相关体格和实验室检查、受试者及其配偶的妊娠和生育情况等。同时，尽可能在合适的随访时间点采集相关样本，使用经过验证的、足够敏感的方法检测基因治疗产品在体内的持续存在情况并分析相关影响，直至数据表明不再有任何风险。如随访过程中出现疑似与基因治疗产品相关的不良事件，应及时根据临床、实验室、分子生物学、细胞遗传学、组织学或.HLA.分析获得的证据或深度测序数据等进行相关性的因果分析，必要时提高随访频率或增加随访内容。对于随访时间超过.5.年的基因治疗产品，完成前.5.年的随访后，可通过电话168、或书面调查问卷等方式，并尽可能采集相关样本，保持每年至少随访受试者一次直至随访期结束。如前期随访提示产品在体内持续存在，建议观察至数据表明不再存在任何风险。申办方向药品监督管理部门递交临床试验申请（IND）时应纳入长期随访的研究计划。长期随访的研究内容可以与不同阶段临床试验方案整合在一起，也可以单独设计为一个研究方案，无论采用何种形式，申办方需注意实施的连贯性和一致性，若临床试验过程中对长期随访的研究计划进行了更新，应确保各阶段临床研究的每位受试者都按照最新的计划进行随访，并及时更新知情同意文件。申办方应在研发期间定期安全性更新报告（DSUR）中总结上一个报告期内长期随访的研究结果，并按照相关169、法规要求及时报告临床试验期间出现的不良事件。（四）不同基因治疗产品的特殊考虑1.关于整合性载体的特殊考虑如受试者接受整合性载体基因治疗产品，例如转座子元件、-逆转录病毒、慢病毒及其他逆转录病毒载体，或利用整合性载体或基于转座子的载体在体外修饰的细胞，长期随访中需格外关注基因治疗产品的基因组整合风险，建议申办方分析基因治疗载体在靶细胞或相关替代细胞的基因组中整合的影响（例如是否存在克隆性生长、是否存在优势克隆、克隆性生长是否导致恶性肿瘤等）。如果基因组整合相关风险的分析可行，应注意以下几点：.在接受基因治疗产品的最初.5.年内，两次检测间的采样间隔建议不超过.6.个月。此后每年至少检测一次，直至170、检测数据表明不再存在任何安全性风险。检测方法的敏感度、特异性和可重复性应经过验证，并设计适当的阳性和阴性对照；59.当体内靶细胞或替代细胞中载体序列阳性的比例超出预期范围时，应开展克隆性生长的评估。如果存在优势克隆或单克隆生长，应在不超过.3.个月的时间内再次检测确认，并尽快开展整合位点的分析。.当载体的整合位点确定后，应与人类基因组数据库及癌基因组的其他数据库等进行比较，确定整合位点的基因功能，评估是否与包括癌症在内的任何疾病有关。如果受试者体内出现载体阳性细胞的克隆性生长，或检测发现基因整合位点在癌基因或癌相关基因附近，应缩短检测间隔至不超过.3.个月并密切监测恶性肿瘤征兆，直至检测不到基171、因治疗载体。.对基于慢病毒/逆转录病毒载体的基因治疗产品，如出现与可复制性病毒可能相关的不良事件，还应开展可复制性病毒（petent.lentivirus/retrovirus，RCL/RCR）的检测。2.关于基因编辑产品的特殊考虑基因编辑产品除了适用基因治疗产品的一般考虑以及整合性载体的特殊考虑外，长期随访中还应额外关注脱靶风险，量化评估脱靶活性和在靶活性之间的相关性，或利用在靶活性来预测脱靶活性的水平。如果基因治疗产品通过全身给药方式递送，长期随访中的安全性监测不仅包括靶器官或靶组织的脱靶活性，而且还应包括可能发生在其他组织和器官中的脱靶活性。基因组整合性或者脱靶活性的分析通常需采用有创性172、检测方法取得样本，实施时还需要考虑技术和伦理上的可行性，例如靶向视网膜或肝脏等组织的基因治疗产品，可能难以对靶细胞采样，这种情况下可能需要通过密切的临床随访等方式间接评估风险；同时，选择易于采样的替代细胞也可能提供关于相关信息，例如靶向骨髓造血干细胞的基因治疗产品，可以通过采集外周血细胞或富集外周血干细胞进行观察。三、上市后长期监测计划的实施建议在临床研究期间，接受基因治疗的受试者人数通常比较有限。同时，在产品获得上市批准时，临床试验中接受了基因治疗产品的受试者通常尚未完成长期随访临床研究，临床试验中的收集的安全性数据不足以评估所有可能的迟发性不良反应的风险。因此，在获得上市批准后，申办方仍可173、能需要继续开展长期随访临床研究，建立产品和使用者的可追溯系统。申办方应按照我国药品上市后监测相关的法规和指导原则要求，建立并完善药物警戒系统，主动收集患者的不良事件信息，鼓励患者主动报告不良事件，提高数据收集质量。60建议申办方在递交新药上市申请（NDA）之前与药品审评部门沟通是否需要开展基因治疗产品的上市后长期随访临床研究，以持续评估产品的安全性和有效性。如需要开展，建议在.NDA.申报时提供上市后研究或临床试验的方案，包括研究目的、研究人群、观察内容和持续时间等。此外，上市后风险管理计划有助于评估和控制基因治疗产品的安全性风险，建议申办方在.NDA.审评过程中与药品审评部门沟通上市后风险管174、理计划的具体内容。参考文献1.U.S.FDA.Long.Term.Follow-Up.After.Administration.of.Human.Gene.Therapy.Products.20202.EMA.Guideline.On.Follow-Up.of.Patients.Administered.with.Gene.Therapy.Medicinal.Products.20093.EMA.Guideline.On.Safety.and.Efficacy.Follow-UpRisk.Management.of.Advanced.Therapy.Medicinal.Products.200175、84.国家食品药品监督管理总局，细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）,.2017.5.国家药品监督管理局药品审评中心，免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）,.20216.国家药品监督管理局药品审评中心，溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则（试行）,.20217.ICH.E6.（R2）:.Integrated.Addendum.to.Good.Clinical.Practice（GCP）,.20168.ICH.E2F.研发期间安全性更新报告，20109.ICH.E2E.药物警戒，200461基因治疗血友病临床试验设计技术指导原则2023 年 4 月62一、概述血友病是一种 X 染色体176、连锁的隐性遗传性出血性疾病，由凝血因子基因突变引起。根据凝血因子缺乏的种类，主要为血友病A（凝血因子Factor.,.F缺乏）和血友病B（凝血因子 Factor.,.F 缺乏）。目前，替代疗法是血友病的主要治疗手段。血友病 A的替代疗法首选重组 F 制剂或血源性 F 制剂，血友病 B 首选重组 F 制剂或血源性F 制剂、凝血酶原复合物。均需要频繁、终生进行输注，以控制和预防出血。基因治疗可针对遗传病基因缺陷的病因进行治疗，常用方法为携带凝血因子基因（或片段），在患者体内进行表达，从而提升患者凝血因子水平到合适的范围。基因治疗为血友病患者提供了新的治疗选择，以期通过单次治疗即实现长期、稳定的凝血177、因子水平，从而减少甚至停止凝血因子替代治疗、减少患者的出血和预防关节畸形和/或残疾。为指导基因治疗血友病临床试验设计和开展，本指导原则从临床试验设计、受试者选择、有效性终点、安全性监测等方面，概述了基因治疗血友病临床试验设计的考虑要点。基因治疗血友病临床试验设计还应参考 ICH 相关指导原则、以及我国药品监管机构发布的有关技术指导原则。随着技术的发展、医疗实践的变化和相关研究数据的积累，本指导原则也将适时进行更新。二、试验设计（一）基本考虑我国目前已有多款血源和重组 F、F 制剂、凝血酶原复合物制剂以及非因子类产品用于治疗和预防相应血友病患者出血。但是受限于其半衰期等因素，目前我国血友病患者需178、要终身不定期或者定期接受这类药物替代治疗。考虑受试者体内可能预先存在针对基因治疗所使用载体的中和抗体，可能给接受该基因治疗的受试者带来安全性风险和有效性减弱的影响，建议在我国血友病人群中，对基因治疗所使用病毒载体的感染情况，如抗体阳性率、抗体水平进行调查研究，以了解该产品在我国患者人群中的适用性。确证性临床试验以年化出血率（Annualized.Bleeding.Rates，ABR）作为主要疗效终点。可使用拟接受基因治疗的受试者入组前接受替代治疗的基线数据（至少 6 个月），作为基因治疗疗效的对照。具体收集数据参考主要疗效终点和次要疗效终点。在基因治疗药物输注后，到受试者体内表达出足够且稳定的179、凝血因子产物前，若受试者发生出血，可使用现有凝血因子产品进行替代治疗。但需注意替代治疗对基因治疗疗效评价的影响。在疗效评价所需的凝血因子水平检测前，应设置替代治疗的洗脱期。63基于现阶段以腺相关病毒（adeno-associated.virus，AAV）为载体的基因治疗血友病的临床试验结果，肝毒性值得关注。已有文献报道在接受基因治疗前预防性使用皮质类固醇，或出现了肝毒性后短期使用皮质类固醇等措施，可以降低或预防肝毒性。临床试验过程中应做好对肝毒性的风险控制，如制定皮质类固醇和/或其它免疫抑制剂的用法用量，并关注对凝血因子活性的影响。如基因治疗产品携带的凝血因子基因与野生型不同，在受试者体内表达180、出的凝血因子分子结构不同，对于凝血因子水平的检测，采用不同检测方法可能对外源性凝血因子水平的检测结果有一定的影响，应关注检测方法的适用性和合理性。基于探索性目的，可用多种方法进行检测和比较。（二）受试者的选择首先应选择确诊为血友病的患者进入临床试验。根据血友病患者凝血因子活性水平可将血友病分为轻型（5-40.IU/dl）、中间型（15.IU/dl）和重型（1.IU/dl）。基因治疗血友病临床试验的受试者优先选择出血频率较高的血友病患者（F 1.IU/dl，F 2.IU/dl）。为最大限度排除患者基因突变本身导致 F /F 抑制物的可能性，建议关键临床试验入组血友病 A 患者需要至少 150 个181、暴露日，血友病 B 患者需要至少 100 个暴露日。由于受试者体内预先存在的针对基因治疗所使用载体的中和抗体可能给接受该基因治疗的受试者带来安全性风险以及削弱潜在的疗效，因此在筛选受试者时，应检测其针对基因治疗载体的中和抗体和凝血因子抑制物，并设置合理的阈值。一般先开展成人的临床试验，对于未成年人的研究应遵守 ICH.E11（用于儿科人群的医学产品的临床研究），并在成人中获得有效性和安全性数据后，考虑未成年人的获益-风险比，包括并不限于基因表达产物持续时间、随肝脏的生长外源导入基因的稀释情况、以及潜在的插入突变风险等，与药审中心沟通同意后再探索在未成年人的临床试验。（三）剂量选择起始剂量的选择182、可参考非临床研究、同类产品临床试验、相同适应症人群临床试验等。为获得适宜的使用剂量，有必要进行剂量递增研究，但应尽量减少无效剂量下受试者的暴露以及减少不必要的高风险剂量的暴露。（四）有效性终点目前阶段基因治疗载体携带的凝血因子基因与野生型凝血因子基因不完全一致，如删除 B.domain 的凝血因子，表达的凝血因子结构和功能可能存在区别，基因治疗载体携64带基因表达的凝血因子可能会比野生型凝血因子活性更高，如凝血因子突变体 Padua。因此，对于基因治疗，以年化出血率为主的临床指标可能仍是目前比较合适的主要疗效指标。其他疗效指标可选择替代治疗情况（替代治疗次数、使用凝血因子总量等）、靶关节数、凝183、血因子水平等。可探索基因治疗后凝血因子活性水平与出血结局之间的相关性，鼓励与监管机构进行沟通。（五）对受试者的监测1.有效性相关的监测为证实基因治疗的获益，应对主要疗效终点 ABR 进行评估。为明确转导基因表达凝血因子的情况，获得凝血因子表达的持续时间和稳定性数据，在受试者接受基因治疗产品治疗后，应结合非临床试验结果，设置合理的凝血因子活性和水平的监测计划。在推测凝血因子水平达到稳定前，可设置较为密集的检测频率，如每周一次或两次；凝血因子水平达到稳定后，可设置适当的检测频率，如每月一次；在治疗后长期随访中，如治疗后 2 年后，可每半年检测一次，持续 5 年。在治疗后随访过程中，还应对血友病性关184、节病的情况进行评估，如对关节功能和结构进行临床和影像学评估。2.安全性相关的监测现阶段在以 AAV 为载体的基因治疗血友病临床试验中发现的最主要的不良事件是肝酶升高。临床试验中应定期检测肝功能，以及时发现和处理肝功能异常。检测频率可参考上文凝血因子水平检测的频率。应根据载体的特征以及非临床研究结果，确定可能存在毒性的靶器官，并加以监测和关注。基因治疗产品的表达产物尤其是凝血因子高活性突变体，表达过高可能存在血栓的风险。在长期随访过程中，应根据载体特征做好相关检测，如插入突变情况等。还应重点检测肝功能、监测恶性肿瘤的发生以及与基因治疗的相关性。目前的基因治疗临床试验中，大多在入组标准中对受试者先185、前治疗的暴露日有一定要求，虽相关临床试验结果表明凝血因子抑制物的发生低于预期，针对具体研发产品，仍应做好入组人群治疗后以及长期随访过程中的抑制物检测。如果使用病毒载体用于携带治疗基因，应定期检测针对病毒载体产生的抗体，以及干扰素分泌水平。还应评估病毒的脱落情况。三、确证性临床试验关键考虑要点血友病已被国家卫健委等多部委联合发布的第一批罕见病目录收录，我国血友病临床指南推荐的治疗药物包括凝血因子替代治疗以及非因子治疗产品等。在现有的治疗方法之65外，基因治疗可能为血友病患者提供更方便有效的治疗选择，从而提高患者生活质量。基因治疗血友病确证性临床试验设计应在前期探索性临床试验的疗效和安全性数据的基186、础上，结合我国血友病患者的治疗现状包括有效治疗药物的可及性等方面科学地设计。一般而言，确证性临床试验主要有效性评估终点应为临床有效性，预设的主要疗效不能差于现有最佳治疗手段。.此外，为确保能提供充分数据，以便能进行安全性和有效性评估及评价抑制物产生的情况，确证性临床试验样本量应综合考虑主要终点指标、安全性、抑制物等方面进行设定。四、参考文献1.中华医学会血液学分会血栓与止血学组、中国血友病协作组.血友病治疗中国指南（2020 年版）.中华血液学杂志,2020,4(4):265-271.2.中华医学会血液学分会血栓与止血学组、中国血友病协作组.血友病诊断与治疗中国专家共识（2017 年版）.中华187、血液学杂志,2016,37(5):364-370.3.ICH.E11(R1)：用于儿科人群的医学产品的药物临床研究.2017.4.国家药品监督管理局药品审评中心.罕见疾病药物临床研发技术指导原则.2021.5.国家药品监督管理局药品审评中心.罕见疾病药物临床研究统计学指导原则（试行）.2022.6.国家药品监督管理局药品审评中心.药品附条件批准上市技术指导原则（试行）.2020.7.国家药品监督管理局药品审评中心.基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）.2020.8.国家药品监督管理局.重组人凝血因子临床试验技术指导原则和重组人凝血因子临床试验技术指导原则.2019.9.国家卫生健康188、委员会.关于公布第一批罕见病目录的通知.2018.10.FDA.Human.Gene.Therapy.for.Hemophilia.Guidance.for.Industry.2020.11.代新岳,.张磊.血友病基因治疗研究进展 J.中华血液学杂志,2018,39(4):350-352.12.严红，任兆瑞，曾溢滔.血友病 B 基因治疗研究进展 J.中国医药生物技术.2017,12(4):330-336.13.刘 嘉 榆，郑 梦 琪，陈 菡 等.血 友 病 基 因 治 疗 的 研 究 进 展 J.健 康 研 究.2020,40(4):421-425.14.Peyvandi.F,.Garagio189、la.I.Clinical.advances.in.gene.therapy.updates.on.clinical.trials.of.gene.therapy.in.haemophiliaJ.Haemophilia.2019,.5(5):738-746.6615.Tsukasa.Ohmori.Advances.in.gene.therapy.for.hemophilia:.basis,.current.status,.and.future.perspectivesJ.Int.J.Hematol,.2020,.111(1):3141.16.George.LA,.Sullivan.SK,.Gi190、ermasz.A,.et.al.Hemophilia.B.gene.therapy.with.a.high.specific.activity.factor.IX.variantJ.N.Engl.J.Med.2017;377:2215-2227.17.Chowdary.P,.Shapiro.S，Davidoff.AM,.et.al.Single.Intravenous.Infusion.of.FLT180a.results.in.Factor.IX.activity.levels.of.more.than.40%.and.has.the.potential.to.provide.a.funct191、ional.cure.for.patients.with.haemophilia.BJ.Blood.2018;132(Suppl.1):631.18.Feng.Xue,.Huiyuan.Li,.Xia.Wu,.et.al.Safety.and.activity.of.an.engineered,.liver-tropic.adeno-associated.virus.vector.expressing.a.hyperactive.Padua.factor.IX.administered.with.prophylactic.glucocorticoids.in.patients.with.hae192、mophilia.B:.a.single-centre,.single-arm,.phase.1,.pilot.trialJ.LancetHaematol.2022;.9(7):504-513.19.Chowdary.P,.Shapiro.S,.Makris.M,.et.al.Phase.12.trial.of.AAVS3.gene.therapy.in.patients.with.hemophilia.B.N.Engl.J.Med.2022;.387:237-47.67人用基因治疗制品总论（公示稿）681.概述基因治疗制品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分可为DNA、193、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞，通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗疾病的目的。依据载体的不同，可将基因治疗制品分为以病毒为载体的基因治疗制品，以质粒DNA.为载体的基因治疗制品，以及以细菌为载体的基因治疗制品，其中以病毒和质粒DNA 为载体的基因治疗制品为常见。本总论是对基因治疗制品生产和质量控制的通用性技术要求，重点针对以病毒和质粒DNA 为载体的基因治疗制品，用于基因修饰细胞（在输入受试者或病人之前用基因治疗载体进行离体或体外修饰的自体或异体体细胞）的载体也适用于本总论，具体品种还应结合制品本身的特性制定相关要求。2.制造2.1 基本要求人用基因194、治疗制品的制造主要包括生产用起始原材料、原材料和辅料的控制，载体的制备，目标成分的提取、纯化和制剂等过程。生产过程中使用的菌毒种和动物细胞基质应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的相关要求。使用的原材料和辅料应符合“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”的相关要求。应采用经过验证的生产工艺进行生产，并对生产工艺全过程进行控制。2.2 载体的设计与构建应基于制品的临床有效性和安全性选择最优的载体设计与构建方案。通常基于基因治疗制品的作用机制，如通过编码功能性蛋白质的转基因表达，或采用 RNA 干扰、小 RNA或基因编辑等方式，采用基因沉默195、、外显子跳跃、基因调控或基因敲除等方式修复、添加或删除特定的基因序列，进行载体的设计与构建。基因治疗制品中使用的载体可以设计为靶向特定组织或细胞，或删除与毒力、致病性或复制能力相关基因的病毒，以确保制品的安全性。用于基因治疗制品的常见的载体系统是病毒载体和质粒 DNA 载体，病毒载体可为非复制型、条件复制型或复制型，每种类型在设计时都应针对安全性方面进行特别考虑。采用非复制型载体要选择尽可能少产生复制活性病毒或能够有效避免辅助病毒风险的方法。69质粒 DNA 载体应考虑抗生素抗性基因可能给病人带来的风险和危害，且不得使用氨苄青霉素抗性基因。2.3 起始原材料用于基因治疗制品生产的起始原材料主要196、包括生产用细胞、细菌或病毒种子。用于生产的细胞、细菌或病毒种子的来源和历史应清晰，应建立至少两级细胞库和/或细菌/病毒种子批系统。应对所有起始原材料进行充分鉴定并建立明确的质量控制要求，确保无细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染。应保证起始原材料的遗传稳定性，并基于细胞库/种子批经长时间培养或多次传代后产物的完整性和一致性，以及其表型和基因型特征等确定生产用细胞库/种子批的最高限度代次。以下是对生产用起始原材料质量控制的一般要求，对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况考虑。2.3.1 病毒种子批病毒种子批的质控项目应包括鉴别（基因扩增、限制性酶切图谱和免疫血清学检测等）、病毒滴度、治疗序列的转197、录/表达、治疗序列或表达产物的生物活性、无菌检查（细菌和真菌）、支原体检查、外源病毒因子、复制型病毒（制品本身为复制缺陷型或条件复制型）等。外源病毒因子应符合“外源病毒因子检查法”的相关要求，同时还应对种子批历史传代过程中可能污染的特定外源病毒因子进行检测。除另有规定外，应对病毒基因组的完整序列进行分析，或至少应确认重要区域（如治疗和调控元件，以及被人为修改的任何区域及其侧翼至少0.5kb内的区域）的序列与理论预期相符。应证明生产用病毒种子批的遗传稳定性、目的基因表达稳定性和生产稳定性。2.3.2 哺乳动物细胞库生产/包装细胞系进行的检测应包括鉴别及纯度、基因分型/表型、成瘤性/致瘤性、遗传稳198、定性、引入序列的鉴别和完整性以及拷贝数等。生产/包装细胞库内、外源病毒因子的检测应根据本版药典要求进行。应确定无细菌、真菌、支原体和螺原体（昆虫细胞）等污染。2.3.3 细菌种子批细菌种子批的质控项目通常包括菌落形态、染色镜检、生化特性、抗生素抗性检查、电镜检查、质粒限制性酶切图谱分析等。应确保不存在其它细菌、真菌和噬菌体的污染。70应检测细菌种子批多次传代后的基因型和表型的稳定性。此外，对于基因修饰的细菌，其基因组重要区域（如引入的治疗和调控元件，以及被人为改造的任何区域及其侧翼至少0.5kb 内的区域）的序列应与理论预期相符。对于经基因改造的质粒不大于 50kb 的，应进行全序列测定。对于199、转导质粒的细菌种子批，应检测质粒拷贝数和有/无质粒细菌的比例。对于生产质粒用途的细菌种子批，应检查质粒产率。对于引入的治疗基因，应检测其表达水平和功能活性。对于减毒细菌载体，应鉴定其减毒的特性和稳定性，并检测其抗生素敏感性。2.3.4 质粒 DNA对用于瞬时共转染生产过程的质粒 DNA，需对其来源、特性、分离纯化方法以及核酸序列等进行描述，对质粒 DNA 的复制起始点、启动子以及编码选择性标记的基因等组成元件的来源和功能进行说明。质粒的生产应基于细菌种子批系统，并符合相关要求。应使用适宜的方法纯化质粒，每批质粒进行鉴别、基因组完整性、质粒含量、质粒纯度、宿主细胞 DNA 残留量、质粒对细胞的转200、染效率、细菌内毒素检查和无菌检查等项目的检测并符合要求，才能用于载体的生产。2.4 原材料及辅料生产过程中所使用的原材料及辅料应符合“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”的相关要求。对可能影响制品安全性的所有原材料（或诸如辅助病毒/包装序列或介质等原材料的组成部分），应评估最终制品或工艺最适阶段中的残留情况，并根据具体情况确定需要控制的残留限度。辅助病毒涉及病毒种子批系统的设计、构建、生产和使用等应符合 2.3 项相关要求。来源于动物组织或体液的原材料应严格控制外源因子污染的安全性风险。生产过程中不得使用青霉素等-内酰胺类抗生素和链霉素，以及其他如溴化乙锭等有毒试剂。用作病毒或 DNA 载201、体递送系统的复合材料必须符合其预期目的，并具有良好的工艺稳定性和产品稳定性。应根据其具体性质和对制品的影响情况进行适当鉴定，并建立相应的检测方法和质控要求。2.5 生产过程的控制生产工艺应稳定可靠，并有明确的过程控制参数，以确保制品安全、有效和全程质量可控。生产工艺的确定应建立在对目标制品的质量属性、生产工艺的深入理解和全面设计基础上。应根据研发早期到规模化生产的整个工艺周期的相关信息，确定原液和成品生产的关键步骤，并依据制品的关键质量属性，确定工艺参数和过程控制项目，并制定相应可71接受标准进行控制，以确保工艺过程的重现性及制品质量的批间一致性。2.4.1 病毒/细菌培养物的制备2.4.1.202、1 病毒培养物的制备（1）细胞培养将工作细胞库细胞按规定传代，同一种病毒生产用的细胞扩增应尽可能按相同的消化程序、分种扩增比率、培养时间及培养条件进行传代。在病毒种子或产品的外源病毒因子检查因制品病毒不能被充分中和而受到干扰等情况下，应在生产中设置对照细胞，对照细胞的外源病毒因子检查应符合本版药典的要求。采用生物反应器微载体培养的应按固定的放大模式扩增，并建立与生物反应器培养相适应的对照细胞外源因子检查。细胞培养过程中需监测细胞的生长状况，并根据生产系统的特点确定监测频率及指标。（2）病毒增殖和收获接种病毒时应明确病毒感染滴度与细胞的最适比例，同一工作种子批按同一 MOI 接种。采用多质粒瞬时203、转染或加入辅助病毒等生产病毒的方式，也应明确加入量与细胞的最适比例。除另有规定外，接种病毒后维持液不得再添加牛血清、抗生素等成分。应根据生产过程中培养、增殖和产物产量一致性的研究资料，确定终止培养、收获产物的技术参数。每次收获后应检测目标产物含量、细菌内毒素、支原体等。应根据生产过程及所用材料的特点，在适宜的阶段进行常规或特定的外源病毒污染检查。检验合格的同一细胞批的单次病毒收获液可合并进行纯化。多次收获的病毒培养液，如单一培养容器出现污染，则与该容器污染相关的病毒收获液不得用于生产。2.4.1.2 细菌培养物的制备（1）细菌培养将工作种子接种于规定的培养基进行培养扩增。自菌种开启到菌体收获应204、有明确的扩增次数规定。细菌培养过程中可进行细菌纯度、细菌总数、pH 值及耗氧量等监测。（2）菌体的收获根据不同的培养方式采用适宜的方法收获菌体。培养物收获后应进行细菌纯度、细菌总数、活菌含量等检测。2.4.2 提取和纯化72采用的分离纯化方法或技术，应能适应于规模化生产并保持稳定。应对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格控制，包括固定相或者流动相中的化学试剂、各类亲和色谱柱的脱落配基或抗体以及可能对目标制品关键质量属性造成影响的各种物质等。纯化工艺应保证将制品的一些特定工艺杂质去除或降低至可接受的水平，包括来自表达载体的核酸、宿主细胞 DNA、宿主细胞蛋白质、污染的外源因子、细菌内毒素、核酸蛋205、白酶以及源自培养液的各种其他残留物等。2.4.3 原液收获液经提取、纯化后分装于中间贮存容器中即为原液。如需加入稳定剂或赋形剂，应不影响质量检定，否则应在添加辅料前取样进行原液检定。原液的检测项目取决于工艺的验证、一致性的确认以及预期的制品相关杂质与工艺相关杂质水平。应采用适当方法对原液质量进行检测，必要时应与参比品进行比较。原液如需贮存，应通过制品稳定性验证确定贮存条件和时间。2.4.4 复合工艺控制对于复合的基因治疗制品，其复合材料的生产以及复合的过程应根据具体的产品情况和工艺特点设置适宜的工艺参数和过程控制要求，以保持工艺稳定性和产品质量的一致性。2.4.5 半成品除另有规定外，制备成品206、前，如需对原液进行稀释或加入其他辅料制成半成品，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受的标准。2.4.6 成品制剂制剂生产应符合本版药典和中国现行药品生产质量管理规范的相关要求。2.4.7 包装及密闭容器系统原液和成品与容器的相容性应符合相关要求。此外，应采用适宜方法对容器完整性进行检测，防止容器泄露导致制品无菌状态的破坏。2.5 生产工艺变更生产工艺变更应符合国家药品注册管理等相关要求。涉及重大生产工艺的变更，应对变更前后的制品质量、安全性和有效性进行比较和评估，以证明变更前后制品特性的高度相似，并确保任何质量属性方面的改变对制品安全和有效性无负面影响。733.特性分析应采用先进的207、分析手段，从生物学、分子生物学、免疫学、物理化学等角度，对基因治疗制品的基因型和表型、纯度、治疗序列活性/生物效价、感染性/转导效率和预期用途的适用性等进行全面的分析，并提供尽可能详细的信息，以反映目标制品内在的质量属性，并作为建立并制定上市制品质量标准的基础。特性分析应包括对原材料、中间体、原液和成品特性的分析。对于复合核酸载体，应充分研究载体、复合组分和复合物的特性。特性分析数据可能来自整个开发和/或制造过程。对于不同阶段（开发、试生产、完整规模生产等）生产的产品批次可根据不同情况开展适宜程度的特性分析研究，其中用于制定上市制品质量标准的产品批次工艺应代表预期的上市制品工艺。特性分析一般在208、研发阶段进行，并通过生产工艺的优化，以及具有代表性的足够批次制品的周期性监测加以完善。特性分析至少应包括以下内容：3.1 结构分析应对治疗序列的选择/调节/控制作用涉及的基因完整序列进行分析，并进行适宜的限制性内切酶图谱分析，以补充鉴定转录/翻译元件和开放阅读框以及其余载体序列。应检测重组载体基因组或质粒的完整性和均一性，载体和治疗序列的遗传稳定性，以及载体递送的治疗序列和选择/调节元件的表型鉴别和分析。对于病毒载体，适当情况下应测定插入位点，并充分评估插入突变的可能性和相关风险；对于质粒，应该证明复制起点的位置以及是否存在 CpG 序列（如果与制品的设计相关）；对于细菌载体，应确认是否存在涉209、及制品安全性的插入/删除序列；对于转导的细菌载体，应检测质粒和相关调控/控制元件的存在及序列。3.2 生物学活性应依据制品的作用机制，尽可能确定与疗效最为相关的质量属性，并建立相应的检测方法。应证明替代、补偿、阻断、修正特定基因的预期作用，对于含有多种活性成分的制品，需要分别建立方法对各个成分的活性进行测定，同时还应考虑活性成分之间可能存在的干扰或协同等作用。在相关细胞类型中分析载体的转导效率和/或拷贝数、转基因表达水平、相关生物活性以及与载体或递送系统的作用机制相关的因素。应分析预期的病毒载体的宿主范围和组织嗜性，或复合核酸递送的选择性，以及转基因表达的选择性。3.3 纯度、杂质和污染物74210、基因治疗制品杂质主要包括工艺相关杂质、制品相关杂质以及外源污染物。应尽可能地对杂质进行分析鉴定，并采用适宜的方法评估其对生物学活性和安全性的影响。在复合核酸的情况下，应考虑到复合物合成和生产所产生的副产品/杂质对复合物的安全性和性能的影响。3.3.1 工艺相关杂质工艺相关杂质来源于生产工艺本身，主要包括起始原材料来源（如残留宿主细胞DNA.和残留宿主细胞蛋白等）、原材料来源（如培养试剂、纯化试剂、辅助病毒和辅助病毒核酸等）和设备材料来源（如工艺中的可浸出物和可提取物、色谱填料脱落物等）的杂质，应对潜在的工艺相关杂质进行鉴定、评估，并进行定性和/或定量分析。在设计为复制缺陷型或条件复制型载体的情211、况下，应分析是否存在残留的复制型或野生型载体及其水平。3.3.2 制品相关杂质应鉴定具有缺失、重排、杂交或突变序列的载体等制品相关杂质，如可行，应对其进行定量。必要时，应对载体中可能存在的共包装外来 DNA 序列进行确认。应分析生产过程中潜在的载体降解情况，如测定感染性/非感染性载体比例、转导效率降低的质粒，或核酸复合物经过氧化或解聚等的降解形式。3.3.3 污染物污染物系指所有引入且并非生产过程所需的物质（如各种微生物、细菌内毒素）。应严格避免引入污染物并对其进行相应控制。3.4 含量应建立基因治疗制品物理数量和生物数量的含量检测指标。可以通过诸如总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组 212、DNA/RNA 或质粒 DNA 浓度等的检测来确定含量。可通过物理、生物物理等方法来测量颗粒的物理数量，或测量病毒颗粒内已知分子量和拷贝数的某种代表性的结构蛋白来评估病毒颗粒数。感染性滴度或感染性颗粒数可采用噬斑形成单位（PFU）、半数组织培养感染剂量（TCID50）等基于细胞的体外检测方法。对于病毒载体，应 TCID50）等基于细胞的体外检测方法。对于病毒载体，应控制总颗粒数与感染性滴度或感染性颗粒数的比例。应尽可能使用标准品或对照品来校准含量测定结果。通过方法学研究确定用于制品放行检定的含量测定方法。753.5 其他特性通常应评估颗粒或分子大小的平均值和分布、聚集体以及折射率等多种理化和其213、他特性及其与制品安全、有效性的关系，必要时应将其纳入制品检定项目中。病毒载体类基因治疗制品，还应对病毒的感染性、毒力、复制能力等特性进行分析。应分析载体脱落，载体复制，插入突变，内源性病毒再激活或与内源性病毒互补的可能性，以及对安全性的影响。复合核酸类基因治疗制品，其复合物的结构以及载体和带负电荷的 DNA 之间的相互作用可能影响制品的安全性和有效性，应充分鉴定复合/递送系统的性质，包括：结构形式、粒度分布、表面电荷、在特定情况和生物环境中的稳定性，以及复合结构内的核酸分布。通过特性研究确定的与关键质量属性相关的特性，如对预期用途有重要影响的复合核酸的生物化学和生物学特性，应建立适宜的方法并纳214、入制品放行检定项目。细菌载体类基因治疗制品，应测定其质粒拷贝数和含/不含质粒细菌的比例。应分析表型、免疫学特性（包括遗传修饰的细菌成分）以及由细菌载体递送的治疗序列和选择/调控元件等。4.标准品/参比品/对照品对于效价、感染性滴度等活性检测方法，应建立具有长期稳定性的活性标准品/参比品。对于鉴别试验、颗粒数等各种理化分析，可选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个（多个）批次，或用一个代表批次作为参比品/对照品，并应按特性分析要求进行分析鉴定。在采用 PCR 或定量 PCR 方法的检定项目中所用到的质粒 DNA 或核酸对照品，在制备和分装后应进行适宜的分析鉴定。标准品/参比品/对照品的建立和制备215、可参照“生物制品国家标准物质制备和标定规程”的相关要求。5.制品检定应根据制品关键质量属性、对制品和工艺的深入了解和风险评估的原则，制定相应质量控制策略。制品检定采用的检测方法应经验证或确认并符合要求。纳入质量标准的检定项目、可接受限度，应结合特性分析数据、临床前和/或临床研究多批次样品的数据、工艺验证批次的数据、稳定性研究数据等综合确定。基因治疗制品的质量检定至少应包括以下项目，但对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况加以考虑。5.1 鉴别试验76根据基因治疗制品的情况，应在核酸序列水平采用限制性酶切图谱分析、PCR、RT-PCR.和核酸序列测定等方法对载体组成、治疗序列、缺失片段以及其他影216、响治疗序列表达的重要部分进行鉴定。还可同时在蛋白水平采用蛋白电泳、免疫印迹、免疫中和试验等方法，对结构蛋白、表达产物、免疫标记、表型特征等进行鉴别。对于复合的核酸制品，应对相应的脂质等复合成分进行鉴别试验。相应的鉴别试验检测中应设置适宜的阳性和阴性对照样品。5.2 纯度和杂质应采用类似正交组合的方法来评估制品的纯度/杂质。5.2.1 总纯度适用的情况下，应采用高效液相色谱（HPLC）、SDS-PAGE、紫外吸收（如 OD260/OD280.比值测定）等方法评估产品的总纯度水平。5.2.2 工艺相关杂质对于工艺相关杂质，应检测细胞来源的污染物的残留水平，例如来自包装细胞系或细菌的宿主细胞蛋白和宿217、主细胞 DNA。对于生产中使用了辅助病毒、质粒 DNA、牛血清、Benzonase.核酸酶、抗生素等的制品，还应分别检测其残留量或残留活性。如在生产中使用了其它对人体有害的试剂，如有机溶剂等，也应在制品中进行相应的检测。生产过程如使用致瘤细胞系，残留 DNA 水平应严格控制并保持在最低水平。采用复制缺陷型或条件复制型病毒载体时，应对复制型病毒或野生型病毒进行检测，且残留水平应控制在一定限度，限度标准应依据制品的非临床和/或临床数据确定；明确具有较大临床安全性风险的，应证明制品中不存在复制型病毒或野生型病毒。经充分验证证明生产工艺对工艺相关杂质已有效控制或去除，并达到可接受的水平，相关残留物的检218、定项目可不列入成品的常规放行检定中。5.2.2 制品相关杂质对制品相关杂质的检测包括非功能形式的载体、共包装的无用基因序列等。例如，在可能的情况下，应控制病毒载体的空壳粒数和聚集体，对于质粒 DNA，应控制不同质粒形式的比例等。5.3 效价根据制品具体情况应建立至少一个反映疗效的生物效价指标。效价测定通常包括对基77因转移效率（感染性/转导效率/传递效率）、治疗序列表达的水平、表达产物的功能或整个制品的直接活性（例如肿瘤细胞杀伤活性等）的测定。效价应尽可能采用定量的方法测定。首选体外生物效价检测方法，如体外感染、转染或转导易感细胞后，对表达产物的功能测定（例如测定酶活性、细胞生长的刺激或抑制等219、）。当转基因表达的生物学功能表现出的活性范围过宽或仅能产生半定量甚至仅为定性结果时，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他定量方法测定治疗序列的表达水平，作为补充的效价测定方法。体外方法不可行时，可采用动物离体组织或动物体内检测方法，必要时可采用转基因动物或移植了人体组织或系统的动物。效价测定需要采用相应的活性标准品或参比品，用于计算供试品的相对效价或作为对照。5.4 含量根据制品组成情况，应对总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组 DNA/RNA或质粒 DNA 的量或浓度进行适宜的组合来测定原液和成品的含量，并用参比品或对照品进行比较计算或作为对照。在制品为病毒载体的情况下，还应进行220、总颗粒数与感染性滴度与感染性颗粒数比例的测定和控制。5.5 一般安全性试验根据制品的具体情况而定，检测应至少包括无菌检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查等。5.6 其他检测项目根据制品的具体情况或具体剂型，通常的检测项目可包括外观、颜色、澄清度、可见异物、不溶性微粒、pH值、渗透压摩尔浓度、装量、水分、赋形剂、粒度和粒度分布、乳光、折射率、zeta 电位、包封率、释放效应等。6.贮存、有效期和标签基因治疗制品贮存应符合“生物制品贮藏和运输规程”规定，成品应在适合的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。标签应符合“生物制品包装规程”要求和国家相关规定，标示内容至少应包括：（1）药221、品名称（2）每瓶的活性单位（如必要）；（3）每瓶有效成分含量；（4）每瓶标示体积（液体制剂）；78（5）批号和有效期。起草单位:中国食品药品检定研究院重组药物室联系方式:010-6709568479体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）国家药品监督管理局药品审评中心2022 年 05 月80一、前 言随着基因递送载体和基因编辑等生物技术的快速发展，基因治疗产品的临床应用不断取得新的进展，为难治性疾病提供了新的治疗方案。基因治疗产品一般通过将外源基因（或基因编辑工具）导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正、增加或敲除特定基因以发挥治疗作用。按照基因导入人体的方式不同，基因治疗可分为222、体内（in.vivo）基因导入和体外（ex.vivo）基因导入两种方式。体内基因治疗产品将外源基因（或基因编辑工具）通过适当的载体直接导入人体发挥治疗作用，而体外基因治疗产品一般在体外将外源基因（或基因编辑工具）导入细胞，制备成为经基因修饰的细胞或细胞衍生产品，最终经回输以发挥治疗作用。由于体内和体外基因治疗产品在产品类型、基因载体类型与设计、载体的靶向性需求、起始原材料的管理、产品的纯度、杂质水平的控制、生产模式和质量风险等方面存在一定差异，因此，两类产品在研发和技术要求方面存在一定的差异，有必要进行分类规范。为了规范和指导体内基因治疗产品按照药品的研发规律和管理规范进行研究，参照 中华人民223、共和国药品管理法、药品注册管理办法等相关法律法规制定本指导原则。本指导原则仅基于当前认知，对此类产品的药学研究提出科学性的建议和一般性的技术要求，相关技术要求对具体品种的适用性应遵循具体问题具体分析的原则，产品研发过程中可基于科学考虑选用其他更有效的方法或技术，但必须符合药物研发的规律并具有充分合理的依据。本指导原则主要针对产品申报上市阶段的药学研究制定，临床试验阶段的药学研究可根据各阶段的研发特点和研究目的，参考本指导原则开展与阶段相适应的研究。由于生物技术发展迅速，尤其在产品设计、质量研究等方面，不同类型产品的药学研究不尽相同，随着技术的发展、认知的深入和经验的积累，本指导原则中的相关技术224、要求也将逐步进行修订和完善。二、适用范围本指导原则中的体内基因治疗产品是指进入人体后，在体内通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表达或调控细胞生物学特性等方式以达到治疗疾病目的的药品。产品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分通常为.DNA、RNA、基因改造的病毒等，部分细菌或真菌也可能被开发为载体应用于基因治疗。产品常见的作用机制如，转录和/或翻译外源目的基因、调节细胞内靶基因的表达水平、对靶细胞的遗传物质进行修饰等，部分产品的作用机制可能需要配合使用蛋白质81成分，如各种基因编辑酶类，以发挥作用。由于体内基因治疗产品组成复杂、多样，对于已有相对成225、熟的技术指导原则覆盖的组成部分（如重组蛋白质成分），本指导原则将不再赘述，可参考相应的技术要求。部分溶瘤病毒产品在设计和作用机制上也可能具有基因治疗产品的特征，可适当参考本指导原则。考虑到生产工艺的差异，本指导原则主要涵盖基于生物技术制备的产品，可能不完全适用于通过化学合成工艺生产的核酸类产品，如反义寡核苷酸类产品及其衍生物。对于多组分或复合型产品，如核糖核蛋白复合物，应分别对各组分和组合产品进行药学研究，并符合相应的技术要求。例如，基于酶的基因编辑技术（如CRISPR-Cas、TALEN、ZFN、Meganuclease.等）而研制的产品，其活性组分可能为.DNA、RNA（如.sgRNA）和226、/或蛋白质。根据工艺特点，化学合成的核酸组分（如.sgRNA）的药学研究在参考本指导原则的同时，还需参考化学合成产品相关的技术要求。蛋白质组分的药学研究应综合参考既往已发布的重组蛋白质类生物制品相关指导原则中的药学研究要求。此外，部分体内基因治疗产品可能需要配合特定的给药装置或作为药械组合产品使用，给药装置或药械组合产品中的器械部分建议参考医疗器械相关指导原则的要求。三、一般原则体内基因治疗产品的药学研究应符合 中华人民共和国药典（以下简称 中国药典）的相关要求，尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求。供人体使用的基因治疗产品的生产应符合药品生产质量管理规范及其附录的相关要求。由于体内基因治疗产227、品的活性成分和作用机制特殊，产品的研发、生产、使用和废弃处理应同时符合生物安全相关法规的要求。1.产品设计、研发和生产的一般要求体内基因治疗产品的药学研究需考虑各类产品的特殊性和研究阶段的适用性。研发过程中，鼓励基于“质量源于设计”的研发理念，探索生产用物料和生产工艺对产品质量的影响，建立产品质量属性与临床安全性、有效性的相关性，持续进行工艺优化和质量提高，建立全过程的质量控制体系和全生命周期的管理理念。体内基因治疗产品的活性成分和作用机制特殊，例如，病毒载体复制特性的变化可能会引起病毒的非特异性感染和扩散，部分产品的基因修饰活性可使细胞的遗传物质或生物学特性发生不可逆的改变，因此，需严格论证228、产品设计、生产和质量控制等各个环节的合理性，在产品研发的过程中建立风险意识，基于风险制定相应的风险控制策略。载体的选择和设计需全面考虑载体的类型、复制特性、基因组整合特性、靶向特性和脱靶风险、规模放大、临床适应症、作用机制、用药方法和给药频率、免疫风险等，生产过程中严格控制外源因子污染的潜在风险，以及监测载体同源/非同源重组的潜在风险，基于质量研究82和关键质量属性的鉴别建立完善的质量控制策略。生产过程需做好生产人员的安全防护和环境安全控制，尤其是病毒载体类产品。生产线的清洗和消毒需经过充分验证，严格控制不同产品之间的交叉污染和同一产品批次间的残留污染。基于环境和生物安全评估制定原材料、中间产229、物及产品的废弃程序，避免活性物质在环境中扩散。2.一般研发规律产品的研发和生产需遵循药物研发的一般规律，逐步完善并持续优化。由于各阶段产品的研究目的不同，不同阶段的研发和生产要求也各不相同。申报临床试验阶段，产品的药学研究应能支持临床试验的开展。该阶段需根据前期研究，结合同类产品的使用情况，对产品的质量风险相关因素进行识别和控制，最大程度地降低产品在人体使用的安全性风险。例如，生产用细菌/病毒种子批和/或细胞库等的制备、检定，以及必要的稳定性评估和/或研究；生产用物料的安全性评估和质量控制；临床样品制备工艺的开发和确认，中间体控制的初步建立；代表性样品的质量研究和早期质量标准的建立；质量控制方230、法的开发和确认，包括安全性检测方法的建立与确认，活性分析方法的初步建立；支持临床试验开展的稳定性研究；容器密封系统的筛选和适用性评估等。非临床研究是评估产品在人体使用的安全性的重要参考依据，需要特别关注非临床研究用样品与临床试验用样品在生产工艺和质量方面的对比或桥接分析，以支持临床试验用样品的安全性评估。临床试验期间，基于工艺开发和对产品质量属性的理解，需逐步明确产品的生产工艺、关键工艺参数、生产过程中的控制项目和关键质量属性等，建立稳定的生产工艺和完善的质量控制体系。研发期间，产品生产工艺可能会随着工艺开发和优化发生变更。由于该类产品的创新性，产品的认知和研究积累在临床试验期间，尤其在早期临231、床试验阶段，可能较为有限，无法充分理解变更对产品质量、安全性和有效性的影响，变更计划的评估和实施应更为谨慎。各类变更方案的实施需建立在与研发阶段相适应的可比性研究的基础上，合理评估变更对产品质量特性的影响，必要时可能需要开展适当的非临床或临床试验桥接研究。上市申请阶段，经过工艺开发最终确定的商业化生产工艺应能持续、稳定地生产出符合目标质量的产品，药学研究数据应能支持产品的安全、有效和质量可控性。同时，制定上市后生产工艺持续验证和优化的工作方案，以更好的保证产品质量。四、风险评估与控制体内基因治疗产品的特点和生产工艺各不相同，不同产品在生产用物料、生产工艺、83质量控制、稳定性等方面存在的风险有232、较大的差异。研发可结合产品和工艺的特点，参考ICH.Q8.和.Q9.的质量风险管理理念，科学利用风险评估工具，基于具体品种具体分析的原则，对生产中的各类风险因素进行识别和评估，根据风险评估结果制定与产品研发阶段相适应的风险控制策略。另外，产品前期知识或同类产品既往使用的安全性数据也可为风险评估提供重要的参考。常见的风险包括（但不限于）以下方面：1.生产用物料方面（1）生产用细胞内/外源因子的污染、细胞特性和遗传稳定性、细胞基因修饰情况、细胞的成瘤性、促瘤和致瘤性风险等。（2）生产用原材料的毒性、免疫原性和外源因子引入的风险；辅料，尤其是新型辅料、复合型辅料的人体使用安全性、免疫原性，辅料的相容233、性和稳定性；生产用耗材理化性质的稳定性，密闭性能和相容性等。2.活性成分方面（1）病毒载体毒种的历史传代和改造情况，载体类型和改造方法，载体的复制特性，基因组整合能力和整合倾向，病毒基因组的稳定性，感染和表达特性，同源和非同源重组的风险，免疫原性，致病性等。（2）核酸序列的正确性和稳定性，调控元件的调控特点，基因和调控元件的致瘤性，靶向特异性和组织表达特性，上靶/脱靶风险，基因组整合特点和整合突变、致瘤风险等。（3）细菌或真菌载体的质粒丢失，抗性变化，或生物学和遗传特性改变。（4）基因编辑工具的靶向特异性和编辑效率，以及编辑工具相关杂质或降解产物对特异性的影响。3.生产工艺方面（1）生产工艺和234、过程控制，工艺变更和工艺偏差，过程中的污染和混淆风险。（2）产品生产与生产环境、人员等的相互影响。4.产品质量方面（1）质量属性表征或质量标准是否全面、充分，对于尚无有效方法进行研究的质量风险是否可控。（2）分析方法是否可以满足质量控制的需求。（3）生产过程中的质量监控，如生产中发生基因重组和突变的风险的控制等。生产84过程和贮存过程中的聚合、聚集、失活、降解、微生物污染、混淆等。5.容器密封系统方面相容性相关风险（如产品的吸附、包装材料的渗出等）和密封性能相关风险。根据全面的风险识别和评估结果，制定合理的质量风险控制策略。控制策略的制定应以降低产品的风险为目的，例如，针对原材料的风险进行质量235、控制，对生产工艺进行充分的表征和验证研究，对质量控制方法进行全面验证，建立从原材料、生产过程到放行检测全过程的质量控制系统，基于质量研究制定合理的质量标准，根据稳定性研究确定产品的贮存、运输和使用条件，根据相容性和密封性研究选择适宜的内包装材料等。风险控制策略的修订应贯穿于产品的全生命周期，随着生产经验的积累和对产品质量属性的理解不断修订和完善。五、产品设计的一般考虑产品设计应基于患者的临床需求，充分考虑产品的预期作用机制、工艺性能、安全风险、有效性等多方面因素，同时还需要考虑产品在贮存、运输和临床给药中的安全性和便利性。由于不同类型产品的设计需要考虑的因素或存在较大差异，本部分主要针对当前主236、要的体内基因治疗产品类型（病毒载体类产品、核酸类产品、细菌载体类产品）提出产品设计需要考虑的一般因素以供参考，具体产品的设计仍需结合产品特点进行综合考虑。由于不同类型的产品在功能或作用机制方面可能具有一定的相似性，因此，产品在设计时可能需要交叉参考其他类型产品的考虑因素。随着基因治疗领域的发展和认知的丰富，产品设计时的考虑因素也将不断补充和完善。1.病毒载体类产品本指导原则中的病毒载体类产品是指通过病毒载体将外源目的基因转移至人体内的基因治疗产品。其中，病毒载体是指经改造用于介导外源基因转移和/或表达的病毒颗粒，常见如腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。根据载体携带的核酸是否整合至237、靶细胞基因组，可分为整合型和非整合型病毒载体；根据载体的复制特性，可分为非复制型、条件复制型和复制型病毒载体。病毒载体和外源基因的选择、设计应根据载体特性、作用机制、人群抗体水平、临床适应症、给药途径和给药频率（即再治疗的潜在需要）等分析和研究确定。1.1 目的基因和调控元件85目的基因是指产品中主要发挥治疗或调控作用的基因或核酸序列，可以.DNA.或.RNA.的形式存在，常见如功能蛋白的编码序列、具有靶向作用的核酸转录序列等。目的基因的选择和设计需考虑疾病的发病机制、产品的作用机制、人种间的序列差异，以及基因表达产物的免疫原性、功能活性和安全性等。由天然序列经密码子优化、基因突变、重组、插入238、、缺失和/或重排等修饰改造而来的目的基因，需有充分的改造依据，并通过体外和/或体内研究确认序列设计的合理性。通过平台计算或根据序列规则设计的发挥靶向结合作用的核酸序列，如.sgRNA、siRNA.等，需评估设计的合理性，并在开发过程中对序列的靶向特异性和上靶/脱靶风险进行评估和确认。目的基因表达调控元件的选择和设计需根据目标细胞的类型、基因表达的调控要求和元件的调控特点确定，评估调控元件对目的基因的表达水平、表达持续性、表达特异性（如适用）等方面的调控是否符合预期，关注调控元件的非预期调控风险，如：元件的远端调控功能，多个相同元件重组导致的基因敲除风险，调控元件的插入对细胞基因组基因的启动、增239、强、终止、绝缘调节影响等。设计时，需对调控元件的致瘤/促瘤性进行评估，避免使用具有潜在致瘤/促瘤风险的元件，若使用，应对相应元件进行改造以去除其致瘤/促瘤特性。若含有以瞬时或组织特异性的方式控制基因表达的调控元件，需对元件相应的调控特性进行确认。1.2 病毒载体选择和设计的一般原则病毒载体的选择和设计一般以有效递送和表达目的基因，降低载体的致病性，降低载体的重组和突变风险等为目的，常见的载体改造方法如删除、重组和/或替换病毒基因等。选择和设计病毒载体时，一般需考虑（但不限于）以下方面的因素：（1）研究野毒株或载体病毒在人群中的基础感染率和中和抗体滴度水平，评估人体免疫反应对病毒载体的体内分布、240、转导效率和治疗效果的影响。（2）尽可能删除安全风险相关的基因或组分，例如可能致病/致瘤的基因，否则，需要评估遗留基因/组分对产品安全性的影响。（3）最少化病毒载体的非必需元件，或对病毒的包装基因进行拆分，降低病毒载体发生重组和回复突变的几率（如复制缺陷型载体）。（4）最少化病毒载体与人体易感病毒或内源性病毒的同源序列，降低重组产生新型感染性病毒或复制型病毒的风险。（5）病毒载体的感染特异性/嗜性和基因转导效率对产品的安全性和有效性均有影响，病毒载体的组织或细胞嗜性应与适应症相符。（6）研究病毒载体基因序列的稳定性，评估序列突变的潜在安全性风险和对有效性的影响。86（7）研究病毒载体的改造对其免241、疫原性、致病性和其他生物学特性的影响，评估对相关抗病毒疗法的敏感性是否发生变化，病毒载体是否可能具有生殖毒性。1.3 病毒载体选择与设计的特殊考虑1.3.1 整合特性整合型病毒载体相比非整合型病毒载体可能具有更长效的体内基因表达活性，但整合过程可能会对人体细胞的基因组完整性或表达特性产生影响。因此，需根据产品设计需求进行选择。对于整合型载体，应尽可能采用当下已知的技术方法对载体进行安全性筛选和/或设计改造以降低插入风险，并在此基础上分析载体在基因组中的整合方式和整合位点的分布趋势，评估其插入导致细胞发生基因突变、基因失活/激活，或细胞癌变的风险。对于非整合型病毒载体，理论上其导致细胞基因组发生242、插入突变的风险相对较小，但仍需开展充分的研究，评估和/或确认载体的非整合特点。例如，对于.AAV（Adenoassociated.virus）等一般认为具有非整合特征的载体，仍有在特定情况下载体整合至基因组的报道，因此需要研究确认以控制风险。另外，由于载体的非整合性，目的基因游离于细胞基因组外，目的基因的表达时效易受载体基因稳定性的影响，且可能因靶细胞分裂而导致目的基因的稀释和丢失。因此，需要充分考虑载体的作用机制，整合风险，以及目的基因的表达时效等选择和设计病毒载体。1.3.2 复制特性.非复制型病毒载体理论上在体内引起病毒扩散或感染失控的风险相对较小，但仍需要通过合理、可靠的检测方法对病毒243、载体的非复制性特征进行确认，同时考虑载体给药途径和嗜性对疗效的影响等因素综合选择和设计病毒载体。非复制型病毒载体的设计和生产病毒包装系统的选择应充分考虑生产和使用过程中通过同源或非同源重组产生复制型病毒的可能，针对出现可复制型病毒的潜在风险建立控制策略，如，对生产过程中适当阶段的样品或终产品进行可复制型病毒的检测等。对于复制型或条件复制型病毒载体，因其复制特性可能引起非特异性感染、免疫应答、细胞溶解等效应，需结合载体特性、结构设计、安全性和预期作用机制等谨慎选用。此类载体在选择和设计时应重点考虑（但不限于）以下方面：（1）结合作用机制和适应症分析病毒载体的体内复制能力的必要性。（2）载体应避免244、包含任何已知的、具有人体致瘤性风险的元件。（3）如果病毒载体进行了改造，需评估改造之后病毒载体的致病性、感染活性等方面的变化情况，并控制相关的安全性风险因素。87（4）病毒载体的组织/细胞的感染和/或复制特异性应与临床治疗机制相适应。必要时，需考虑设计增加载体的体内失活或清除机制。1.3.3 靶向特性病毒载体类产品的疗效和安全性，与病毒载体的感染特异性/嗜性和/或目的基因的表达特异性密切相关，因此，载体的选择和设计需考虑载体的组织/细胞嗜性，结合受体分布特点，以及目的基因表达调控的细胞特异性等因素。不同给药途径对病毒载体的靶向分布也有重要影响。开发过程应基于载体的选择和设计、体外生物学特性研究245、，以及非临床研究、临床试验等多个方面对载体的靶向特异性/嗜性、目的基因的表达活性和表达调控（如适用）进行确证。2.核酸类产品本指导原则中的核酸类产品是指具有特定功能的核酸活性成分通过物理或化学介导的方式进入人体细胞后，在细胞内经转录、剪切、翻译，或直接发挥作用的产品，产品常见的活性成分为.RNA.或.DNA。根据作用机制的不同，核酸类产品可以.mRNA、shRNA（Short.hairpin.RNA）、miRNA（Micro.RNA）、质粒.DNA、微环.DNA（Minicircle.DNA）等单一活性成分发挥功能，也可由.RNA、DNA.和蛋白质中的两种或两种以上成分组合形成功能系统发挥作用246、，如 CRISPR-Cas.系统。核酸类产品进入人体细胞往往需要借助一定的物理转导装置（如电转染）或化学递送辅助介质（如脂质体复合物、阳离子多聚物、阳离子多肽等）以提高核酸的转染效率，部分具有核酸运输功能的多肽、抗体、配体等也可协助核酸的转运。核酸类产品的结构、目的基因和相关调控元件的设计应具有合理的科学依据，充分考虑各类核酸活性成分的特点和作用机制，使其符合预期功能。核酸类产品设计时，目的基因和调控元件的设计可参考病毒载体类产品“1.1.目的基因和调控元件”中的一般要求。此外，基于产品特点，可能还需考虑以下（包括但不限于）方面的因素：（1）对 于 通 过.shRNA、miRNA、CRISPR247、-Cas、锌 指 核 酸 酶（ZFN）、TALEN.或.Meganuclease.等靶向结合目标基因序列或基因表达产物序列以发挥功能的产品，应考虑产品的靶向特异性和脱靶引起的安全性风险，降低目的基因序列与非目标序列的同源性，优化相关核酸酶结构，提高结合或编辑的特异性。（2）对于.CRISPR-Cas、ZFN、TALEN.或.Meganuclease 等在细胞内通过对基因组进行编辑发挥作用的产品，应考虑基因组缺口或双链断裂引起的基因错误修复和基因组结构重排的风险。同时，需考虑编辑酶的作用持续时间，以及编辑酶残留对基因组稳定性和细胞毒性的影响。88（3）对于转座子等具有基因组整合特性的产品，应考虑248、产品的整合位点特异性或整合位点的分布趋势、基因整合的稳定性，以及整合引起的插入突变和致瘤性风险等，合理设计载体序列、转座酶/转座.DNA.的比例、转座基因数量、转座酶表达持续时间及表达调控元件等。（4）对于.mRNA.类蛋白质编码序列，应考虑.5-帽或类似物结构的类型和设计、poly.A.尾的序列和长度及长度分布、翻译调控元件、核苷修饰类型、序列自我复制能力、递送系统等对产品的免疫原性、表达活性和载体稳定性的影响。（5）核酸类型和结构与其体内的表达持续时间是否相适应，核酸的自我复制（Self-amplifying）功能和基因持续表达的必要性和安全风险，产品的基因组整合功能和对靶细胞基因组进行基249、因修饰的功能的必要性。（6）产品的核酸结构和序列的稳定性、基因毒性和免疫原性。（7）核酸序列中应避免含有致瘤性基因。如有可能，应尽可能去除非必需元件和筛选用基因（如抗生素抗性基因）。（8）化学递送辅助介质的化学稳定性、人体安全性、转染效率，以及递送介质之间、递送复合物的相容性。如有可能，可考虑通过递送辅助介质的设计和筛选，增强产品体内的靶向性/嗜性，或降低免疫原性。3.细菌载体类产品本指导原则中的细菌载体类产品是指经基因修饰后作为载体，用于在人体内表达目的蛋白或特定核酸序列的细菌微生物，如沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌等细菌改造所得的产品。细菌载体的构建一般基于野生菌株的结构和生物学特性，通过转250、入质粒、游离型载体（Episomal.vector），或对菌株的基因组进行修饰而完成。细菌载体的改造应基于合理的科学依据和产品作用机制，以降低或去除微生物的致病性，实现或增强载体的治疗功能为目标。载体的设计和构建应关注改造后细菌载体的遗传特性、生物学特性、致病性、目的基因表达活性、载体的体内分布特性、对人体正常菌群的影响、环境安全性、基因的水平转移，以及对常规治疗方法的敏感性等方面的变化情况。细菌载体的改造应避免使用-内酰胺类抗生素抗性基因。外源目的基因的设计可参考病毒类产品“1.1.目的基因和调控元件”中的一般要求。六、生产用物料本指导原则中的生产用物料是指生产过程中所使用的所有生物材料和化251、学材料，包括起始原材料（如细胞基质、细菌、毒种、质粒等）、生产过程中使用或添加的物料（如培89养基及其添加成分、工具酶、纯化填料、缓冲液等）、辅料，以及生产用耗材（如培养袋、储液袋、移液管路、滤膜等）等。生产用物料与产品的质量、安全性和有效性密切相关，应通过风险评估选择适合产品特点且供应稳定的物料。规范建立生产用物料的质量管理体系，包括风险评估、供应商审核、风险和质量控制等，保障产品质量，降低生产用物料相关的质量风险。1.起始原材料体内基因治疗产品类型不同，生产起始原材料或存在一定差异，常见的起始原材料包括质粒.DNA、细菌种子批、病毒种子批、产毒细胞株/库等。起始原材料应有清晰的来源和完整的252、溯源信息，一般应按照中国药典的要求进行建库管理。起始原材料的质量控制应根据其类型、特性、历史溯源信息、制备过程，以及产品的类型、生产工艺、给药途径等方面的风险确定，质量控制应与其风险相适应。1.1 质粒 DNA体内基因治疗产品生产用的质粒.DNA，可瞬时转染用于生产病毒载体，体外转录用于.RNA.核酸产品生产，或经转染/转化用于细菌种子、病毒种子和细胞系的构建。各类质粒 DNA.的结构、基因和元件设计应符合前述的一般原则和预期用途，构建所用的原始质粒的来源和序列应明确，构建过程中应对各步构建结果进行确认。质粒序列，尤其是作为终产品活性组分的序列中，应不含具有潜在致瘤风险的基因或元件，如有必要，253、应对此类基因/元件进行替换或改造。为避免抗生素滥用和由抗生素残留引起的过敏风险，建议避免选用-内酰胺类抗生素抗性基因作为质粒的筛选基因。除细菌种子批、病毒种子批或细胞系构建过程中一次性使用的质粒外，起始原材料质粒.DNA.应基于细菌种子批系统，采用经验证的发酵和纯化工艺制备，质粒生产规模应与后续生产步骤的规模相适应。质粒.DNA.的质量标准一般包括质粒鉴别、含量、纯度、完整质粒或重要基因序列的确认、超螺旋比例、无菌、细菌内毒素、抗生素残留（如适用）、一般理化性质（如.pH.值等）、工艺相关杂质（如宿主菌.DNA 残留、宿主菌.RNA.残留、宿主细菌蛋白质残留等）等，具体项目应根据质粒的制备工艺254、和用途分析确定。每批质粒通过放行检测方能用于产品生产。质粒的贮存稳定性应能支持后续生产步骤的生产。细菌种子、病毒种子或细胞系构建过程中一次性使用的质粒，可不通过细菌种子批系统制备，但应对质粒序列进行确认，同时避免污染风险。瞬时转染用于病毒载体包装的质粒，应考虑前述病毒载体设计的一般要求。为了降低病毒生产和使用过程中重组产生可复制型或假野生型病毒的风险，建议优先选择经验证具有较高安全等级的病毒包装系统，将病毒包装必需元件适当拆分至不同的质粒中，尽量去90除非必需的病毒基因，降低质粒之间，质粒与包装细胞及野生病毒序列之间的同源性。例如，AAV.包装系统构建时，将.AAV.的结构基因分离于不同质粒的255、转录单元中，并尽可能降低.Rep/Cap.基因序列和.ITR 等序列之间的相似性等。1.2 细菌种子批细菌种子批可用于核酸类基因治疗产品（如质粒.DNA、minicircle.DNA、mRNA.等）生产，也可能经培养后作为细菌载体类基因治疗产品。菌种的来源应明确，细菌种子批的制备过程应清晰、完整，制备过程应尽量避免使用人源或动物源性原材料，并对种子批的单克隆性进行确认。细菌种子批的制备和检定应符合中国药典通则“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“人用基因治疗制品总论”的要求，种子批的检定一般包括菌落形态、鉴别、染色镜检、生长特性、生化反应特征、活率、抗生素抗性、电镜检查、质粒测序、限制256、性酶切图谱、转基因的表达和/或活性分析（如适用）等，细菌种子批应无其他细菌、真菌、噬菌体等污染。经基因修饰的细菌载体应关注修饰后细菌的表型和基因型，对基因组或基因组的重要区域（如引入的治疗基因和调控元件，以及目的基因侧翼至少.0.5kb.内的区域）进行测序确认，对改造基因的插入位点、基因拷贝数等进行分析，必要时应检测目的基因的表达水平和功能活性。对于经减毒改造的细菌载体，应鉴定其减毒的特性和稳定性，并检测其抗生素敏感性的变化。质粒等生产用的细菌种子批或含有质粒、附加体的细菌载体种子批，应对含有的质粒或附加体序列进行确认。考虑传代过程中细菌的生长特性、基因组整合或修饰基因、目的基因的表达和活性、257、质粒序列、质粒拷贝数和质粒丢失比例的变化，需用模拟或代表实际生产工艺的条件开展传代稳定性研究，种子批的遗传和表型特征应能满足生产需求。细菌种子批的贮存稳定性应能满足生产需求。1.3 生产/包装细胞库生产/包装细胞库用于病毒包装和生产，可影响病毒载体的质量和产量，可能存在引入外源因子的风险，细胞培养残留的细胞蛋白质、DNA.等杂质具有一定的免疫原性，部分细胞的裂解产物或 DNA 可能还存在一定的致瘤性风险。另外，体内基因治疗产品开发中可能适用的生产/包装细胞类型较多，如具有或不具有成瘤特性的传代细胞株/系、昆虫细胞系等，不同细胞可能存在不同类型的风险。基于以上原因，应优先选择来源明确，培养历史清258、晰，且无病毒污染的细胞基质用于病毒包装和生产。若使用含有内源性病毒的细胞基质，应评估其使用的必要性和安全性，如，内源病毒的人体感染活性、免疫原性、91工艺残留水平、病毒基因表达活性等，必要时应在工艺中增加经验证的病毒去除/灭活工艺单元，并在适当的阶段对病毒的残留和活性进行检测。对于成瘤性或致瘤性风险未知的细胞，尤其是新型细胞基质和新建细胞株/系，需参考中国药典的相关要求评估生产/包装细胞的相应风险，必要时开展相应的研究。由于肿瘤细胞系的成瘤或致瘤风险相对较高，建议谨慎选用。如使用具有成瘤性的细胞，需结合临床风险获益、给药途径和生产工艺的杂质去除性能（如活细胞残留、致瘤基因片段的残留等）等评估其259、使用的必要性、合理性和安全性，分析细胞中是否携带具有致瘤风险的基因或其他因子，必要时应对其残留水平和基因片段大小进行控制。一般不建议使用具有致瘤性的细胞。另外，需通过生产过程控制和/或产品放行对完整细胞，尤其是成瘤性细胞的残留水平进行控制。为了保证产品质量的稳定性，生产/包装细胞需进行建库管理，细胞库的制备和检定应符合中国药典通则“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。细胞库的检定一般包括：细胞鉴别、细胞数量、活率、基因型和表型（如适用）、生长特性（如适用）、外源因子等，对于成瘤特性不明的细胞，建议进行成瘤性检查。外源因子检测一般包括无菌、支原体、螺原体（昆虫细胞，或生产过260、程中使用了植物源性成分）、外源病毒因子等。外源病毒因子的检测可按照药典要求，结合细胞改造特点进行风险评估后确定，一般应包含非特异性病毒、逆转录病毒、细胞种属特异性病毒，以及细胞建株或细胞库构建培养过程可能引入的潜在外源病毒因子。细胞培养历史或培养过程中如使用了牛血清、猪胰酶等动物来源的原材料，应进行牛源性、猪源性等相应动物种属相关病毒的检测。基于生产的需要，若对细胞基质进行了遗传修饰，如组成性表达病毒包装蛋白或复制辅助因子等，应考虑基因修饰的必要性和修饰方法的适用性，修饰过程不应增加外源因子引入的风险，修饰基因的选择应尽量避免或降低病毒包装过程发生重组的风险。例如，腺病毒等非复制型或条件复制型261、病毒载体应使用不含同源序列或同源序列较少的细胞系用于病毒载体生产，降低生产/包装过程中的重组风险。对于经基因修饰建立的稳定传代细胞株/系，细胞库的表征研究中还应对基因修饰的结果，如基因序列、修饰位点、拷贝数、表达水平等进行确认。为了确认限定代次内的生产/包装细胞能生产出质量稳定的病毒载体，需在模拟或代表实际生产工艺条件下开展细胞传代稳定性研究，根据研究结果确定细胞库的生产限传代次。限传代次内的细胞应不影响包装病毒的遗传和表型特征，能支持病毒的生产。对于新型细胞基质或新建细胞株/系，需关注其传代过程中成瘤性的变化，必要时还需对其致瘤性进行研究；经基因修饰的稳定传代细胞株/系，需关注传代过程中病毒262、包装基因的序列和拷贝数是否稳定，病毒包装产物质量是否均一且满足质量要求。1.4 病毒种子批92生产用的病毒可能包括病毒载体种子和/或包装用病毒，其来源、培养历史、构建过程应清晰、完整，病毒特性需满足生产的需求，且经评估其安全性风险应可控。对于培养历史不清晰，存在其他非目的病毒污染风险，或毒株单克隆性无法保证的病毒种子，建议谨慎选用。如需使用，可在构建过程中采用多轮噬斑纯化、有限稀释纯化，或通过.DNA/RNA 拯救等方式，以确保毒株的纯度和单克隆性。病毒载体种子和包装用病毒等可建库的病毒种子应建库管理，以减少产品的批间差异。病毒种子批的质量控制应符合中国药典“人用基因治疗制品总论”的要求，检验263、项目应根据种子批的特征、培养历史、建库过程等具体确定，一般包括鉴别（基因组和免疫血清学特征）、病毒滴度、目的基因序列的转录/表达（如适用）、目的基因序列表达产物的生物学活性（如适用）、病毒载体外源因子污染（如细菌、真菌、支原体、外源病毒等）、复制型病毒（载体为非复制型或条件复制型）等。另外，需要关注种子批历史传代和构建过程中可能引入的特定外源因子，如昆虫包装细胞可能引入的螺原体、弹状病毒等种属特异的外源因子。病毒载体的基因组序列应与理论序列一致，如有差异，需分析突变的来源和病毒基因组的稳定性，以及突变对产品质量、安全性和有效性的影响。病毒种子批的传代稳定性研究应能代表或模拟实际生产的工艺条件，264、关注病毒种子批的遗传稳定性、目的基因的表达特性、复制特性和产品质量变化等，根据传代稳定性研究结果合理拟定病毒种子批的生产限传代次。开展病毒种子批的贮存稳定性研究，病毒种子批的贮存应能满足生产需求。2.其他生产用物料其他生产用物料是指除起始原材料外，其他在生产中使用的原材料（如工具酶、抗生素、培养基、去污剂、纯化试剂等）、辅料和耗材等。生产过程中所使用的原材料应符合中国药典通则“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”的相关要求，原材料的质量应符合其预期用途，关键性原材料建议优先选用药品监管机构批准的产品或药用级别的原材料。原材料的选用应经过充分的评估，其来源、组分、功能、质量、使用阶段、用量等情况265、应明确，尽量不使用非必需的原材料，降低原材料残留和引入外源因子的风险。全面审核原材料生产相关的风险因素以及原材料生产商对相应风险的控制，根据风险评估建立合理的内控标准。如有可能，应避免选用血清、猪胰蛋白酶等动物或人来源的原材料，尽量以成分明确的血清替代物或重组制品替代。若经研究认为必须使用，应采取必要的风险控制措施（如 射线辐照处理等），并针对原材料的物种来源、生产地区、生产工艺、质量标准等建立完整的质控体系，评估其.TSE/BSE.安全性风险。严禁使用海绵状脑病流行疫区来源的易感动物制备的原材料，不得使用未经过安全性检验的血清/血浆。评估生产用试剂的安全性，避免使用.-内酰胺类抗生素、93链266、霉素，以及其它如溴乙锭等有毒有害试剂。如在生产中使用了有毒、有害的原材料，应证明下游的纯化工艺能将其良好的清除，或进行使用警示。辅料相关要求请见“七、生产工艺”项下“1.2.2.辅料”部分。生产过程中使用的耗材和容器，如一次性反应袋、移液管路、储液袋、滤膜等，应具有稳定的物理和化学特性，耗材与直接接触的溶液、生产中间产物等应有良好的相容性。根据耗材的材质、使用阶段、供应商研究等因素对耗材、容器的相容性进行评估或研究。七、生产工艺1.生产工艺开发生产工艺一般是指从细胞或细菌微生物的培养/发酵、纯化到终产品分装、贮存的全过程。由于产品类型不同，不同产品的生产工艺可能存在较大的差异，如质粒、病毒载体267、类产品，生产工艺中可能涉及诱导表达、质粒转染、病毒感染等操作，RNA.等部分核酸类产品，也可能采用非细胞体系的体外转录工艺用于生产。生产工艺的开发应基于对目标产品质量概况的理解，结合生产工艺与产品质量之间的相关性，通过工艺研究，逐步完善工艺，完成从实验室到商业化规模生产的开发过程，最终明确工艺步骤和关键工艺参数。若采用缩小模型用于工艺研究，应对缩小模型的代表性进行确认，以支持其研究结果能充分代表实际生产工艺。如可行，建议尽量采用密闭式的生产工艺，减少生产过程中的环境暴露和储存环节。生产过程如存在中间产物的暂存，应对暂存条件和暂存时限进行研究和验证。基于风险分析，建立全过程的控制策略，合理设定生268、产过程中的控制，尤其是生产过程中外源因子的污染和关键中间产物的质量控制。生命周期中，生产工艺应随着工艺技术的进步和对产品理解的深入不断优化，针对工艺变更进行相应的可比性研究，以保证产品质量。1.1 原液工艺开发1.1.1 发酵/培养工艺起始于细菌种子批发酵或生产/包装细胞培养的生产工艺，发酵/培养过程可直接影响产品的质量。基于对产品质量属性的理解，需要对发酵/培养条件，如发酵/培养的规模和模式、培养基及添加成分、培养温度、pH.值、渗透压、搅拌速度、pCO2、溶氧量、培养时间、接种条件、转染/感染条件、收获时间等进行充分的研究，制定适合生产的条件和参数。例如，病毒载体包装工艺的开发应考虑提高载269、体的包装效率和包装准确性，减少空94载体、错误包装载体、无活性载体、游离核酸等产品相关杂质的形成；质粒.DNA、微环.DNA.等核酸产品，应考虑核酸的序列正确性、结构完整性、重组效率（如微环.DNA.等）及构象等。发酵/培养过程中应避免引入不必要的工艺相关杂质，在适当的步骤对杂质和/或外源因子进行检测。对于病毒载体的包装生产，一般建议对未处理的培养收获液的外源因子污染进行检测。在病毒种子或收获液的外源因子检查因产品病毒不能被充分中和而受到干扰的情况下，可在生产中设置对照细胞，用对照细胞进行外源因子检查。对于非复制型或条件复制型病毒载体，应在适当的工艺阶段采用敏感的方法对可复制型病毒进行监测。1270、.1.2 体外转录工艺mRNA.等通过体外转录方式制备的核酸产品，可通过对原材料、转录模板和转录条件的研究，控制转录产物的质量。转录用的重要原材料，如核苷酸、修饰核苷酸、5-帽或类似物、工具酶（如转录酶等）等应进行适当的质量控制，可关注其纯度和杂质，转录酶还需关注其保真度等。转录模板的制备应能确保模板的序列准确性和纯度，减少杂质残留。体外转录条件应经过充分的研究，提高转录序列的准确性、均一性和完整性，减少副反应产物，如不完整.RNA、双链.RNA、截短.RNA、长链.RNA.等的形成。1.1.3 纯化工艺纯化工艺应根据产品类型、上游工艺和潜在的杂质情况而确定，在不影响产品完整性和活性的同时，应271、能稳定去除或降低工艺和产品相关杂质。培养阶段若使用了辅助病毒、包装用病毒，或具有其他潜在的病毒污染风险，应根据目标产物与非目标病毒之间的理化性质差异，在纯化过程中增加必要的病毒去除/灭活工艺步骤，如去污剂灭活、低.pH.灭活或除病毒过滤等工艺单元，控制非目标病毒残留的安全性风险。纯化过程中，可考虑在关键步骤对外源因子污染和产品质量进行监测。1.2 制剂工艺开发1.2.1 制剂处方剂型的选择需考虑产品贮存和运输的稳定性，临床用药的便利性和安全性等多方面因素，在可达到临床治疗目的的前提下，尽量设计和选用易于贮存、运输和使用的剂型。制剂处方的设计需与剂型相适应，应能有效维持产品的功能活性和稳定性，满272、足临床用药需求。部分产品由于稳定性较差，需要采用低温、冷冻或冻干等条件进行贮存，制剂处方中95往往需要添加冷冻保护剂、冻干保护剂、活性保护剂等具有特定功能的辅料成分。在保证产品活性和稳定性的前提下，处方的设计和筛选应尽量选择结构简单、组分明确、质量可控、安全性风险较小的处方辅料。辅料的选择依据应充分，作用应明确，用量应合理，并有相应的研究数据支持。尽量避免选用毒性高，安全性风险大的辅料。1.2.2 辅料辅料是指产品配方中使用的辅助材料，如稳定剂、缓冲体系等，其选择、用量和质量标准应基于制剂的处方开发确定。辅料质量应满足其预期功能，并符合中国药典通则“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”的相关要273、求，优先选用符合药用标准的辅料。如使用多种来源（如动物、植物与合成来源）或多个供应商的辅料，尤其是脂质体等复杂的辅料，应按照来源和辅料变更风险分别开展相应的产品特性检定和可比性研究，以证明采用不同来源辅料所生产的产品具有等效性。处方中若含有在人体内首次使用或在拟定给药途径中首次使用的新型辅料，应根据辅料生产相关的风险因素系统评价辅料的安全性并制定相应的质量标准。在缺乏人体安全性研究数据支持的情况下，需参照新药用辅料非临床安全性评价指导原则进行研究。核酸类产品常需配合使用一定的化学递送材料/介质以促进或提高核酸的转染效率，常见如纳米粒子、脂质体、阳离子聚合物等。由于辅助递送材料/介质与常规辅料不274、同，在核酸类产品的体内递送过程中具有保护、转染和/或胞内释放等辅助作用，可认为其属于功能性辅料。递送材料/介质的选择需要有合理的依据，对材料/介质本身一般应考虑材料/介质的生产工艺、质量控制、人体安全性、材料/介质的稳定性等，对递送材料/介质与核酸组成的递送系统，还需考虑系统的核酸保护作用、递送效率、胞内核酸释放功能、递送系统的稳定性，以及递送系统的工艺稳定性和质量变化等。对于多组分递送系统，应对系统各组分分别进行质量控制和安全性评估，同时对系统组分之间的相互作用和系统的稳定性进行研究，确定其是否符合预期功能。1.2.3 制剂生产工艺制剂生产工艺需结合产品特点、制剂处方、剂型等研究确定，规模应275、与原液生产规模相匹配，尽量避免生产过程中混合批次的操作。如确需混合，应对混合工艺进行充分验证，各混合批次需按照规定的工艺生产并符合拟定标准。开发过程中可能需要关注处方的配制方式、工艺操作时间、灌装准确度、无菌条件的控制等，冻干等特殊剂型还应对制剂的冻干曲线进行研究。对于.mRNA.等核酸产品，核酸与递送材料/介质的复合/包封过程可能需要关注温度、投料比、溶液浓度、搅拌速率、缓存体系、混合流速和混合顺序等对递送系统质量有重要96影响的工艺参数，关注复合/包封过程和纯化步骤对复合/包封率、颗粒形态、颗粒聚集/解散、核酸泄露、杂质残留、核酸完整性和稳定性等的影响，合理设定过程中的控制项目。1.3 工276、艺开发过程中的优化与变更生产工艺可能会随着工艺的开发发生变更，如生产场地的变化、设备的改变、原材料的替换、工艺的优化、规模的扩大、质量控制策略的调整等，变更的实施应基于充分的可比性研究。可比性研究可参考.ICH.Q5E.的一般原则，基于变更的风险评估建立可比性研究方案或桥接计划。风险评估中，应考虑产品的研发阶段、变更的类型、变更涉及的工艺等对产品质量的影响。早期临床试验阶段，由于生产工艺尚未最终确定，批次数量较少，工艺变更可基于有限批次的研究数据进行可比性研究，但应关注安全性、纯度、杂质、结构、含量等相关质量属性的变化；随着批次数据的积累和对产品工艺、质量理解的深入，变更的实施应基于更全面和严277、格的可比性研究。根据变更类型的不同，药学对比可能包括工艺和过程中控制、放行检测、拓展的质量研究、稳定性等多个方面。对比研究的批次应根据变更的类型、质量属性的重要性和变异度、数据分析方法和研发阶段确定。一般认为，风险/影响较高的变更需要在过程控制、表征研究、放行检测和稳定性等方面进行更全面和更多批次数据的统计分析。在产品质量属性非完全可比的情况下，应对研究中观察到的质量差异进行评估。当现有认知或平台经验无法预测质量属性的差异对产品安全性和/或有效性的影响，或产品质量变化预期可能会对产品安全性和/或有效性产生不利影响时，应考虑进一步增加非临床和/或人体的桥接研究数据。由于目前基因治疗产品的认知和应278、用经验较为有限，一般不建议在确证性临床试验开展阶段或结束后对生产工艺进行重大变更，此阶段的变更可能会增加可比性研究的复杂性和结果的不确定性，甚至会影响临床试验数据的可接受性。产品开发过程中，应注意做好阶段性或代表性工艺样品的留样工作，以便于后期的回顾分析或可比性研究。2.生产工艺的确认与验证工艺开发过程中，根据阶段性研究目的不同，需要开展与阶段相适应的生产工艺确认或验证研究。临床试验申请阶段，应对临床研究用样品的生产工艺进行确认，同时做好生产过程中的风险控制，如外源因子的污染、交叉污染、产品混淆等。商业化生产工艺确定后，应在上市前采用代表性的商业化生产工艺进行规范的工艺验证。验证研究的内容应根279、据产品的生产工艺和风险分析确定，一般包括细胞培养、转导/转染、体外转录、纯化、制剂等所有工艺步骤。验证研究的批次数量与工艺的复杂性、变异度，以及前期工艺研究的充分性、平台经验等有关，一般不少于三批，如有其他特殊情况，建议提前与监管机构开展97沟通交流。验证研究应关注各步工艺的可控性、中间产物的质量和工艺性能的稳定性，针对验证过程中出现的偏差，开展偏差调查，并根据调查结果制定纠正方案。此外，验证研究可能还包括（但不限于）生产工艺的无菌验证、滤器除菌验证、填料和膜包的使用寿命研究、运输验证、清洁验证、设施和设备验证等，生产过程中若存在中间产物的暂存，还应对中间产物的暂存条件和时限进行研究。验证研究280、的结果应能证明工艺的稳定性、控制性、过程中控制项目设定的合理性。上市后，应在商业化生产过程中开展持续的验证研究。2.生产工艺的确认与验证工艺开发过程中，根据阶段性研究目的不同，需要开展与阶段相适应的生产工艺确认或验证研究。临床试验申请阶段，应对临床研究用样品的生产工艺进行确认，同时做好生产过程中的风险控制，如外源因子的污染、交叉污染、产品混淆等。商业化生产工艺确定后，应在上市前采用代表性的商业化生产工艺进行规范的工艺验证。验证研究的内容应根据产品的生产工艺和风险分析确定，一般包括细胞培养、转导/转染、体外转录、纯化、制剂等所有工艺步骤。验证研究的批次数量与工艺的复杂性、变异度，以及前期工艺研究281、的充分性、平台经验等有关，一般不少于三批，如有其他特殊情况，建议提前与监管机构开展沟通交流。验证研究应关注各步工艺的可控性、中间产物的质量和工艺性能的稳定性，针对验证过程中出现的偏差，开展偏差调查，并根据调查结果制定纠正方案。此外，验证研究可能还包括（但不限于）生产工艺的无菌验证、滤器除菌验证、填料和膜包的使用寿命研究、运输验证、清洁验证、设施和设备验证等，生产过程中若存在中间产物的暂存，还应对中间产物的暂存条件和时限进行研究。验证研究的结果应能证明工艺的稳定性、控制性、过程中控制项目设定的合理性。上市后，应在商业化生产过程中开展持续的验证研究。对于病毒载体等基因治疗产品，若工艺中存在病毒去除282、/灭活单元，可适当参考.ICH.Q5A，对工艺的病毒去除/灭活效果进行验证，根据验证研究结果进行安全性评估。验证研究应能证明，工艺能有效去除或灭活生产过程中使用的包装用病毒、内源性病毒等非目标病毒，同时，目标病毒载体的活性和结构等特性不会受到非预期影响。八、质量研究与质量标准1.质量研究质量研究贯穿于产品的生命周期，随着认知的深入和分析技术的发展不断补充和完善。根据研发的阶段或研究目的的不同，质量研究可选择相应工艺生产的代表性批次（如非临床研究批次、中试工艺批次、临床样品批次或商业化工艺验证批次等）和适当生产步骤的样品（如起始原材料、生产中间品、原液、制剂等）进行研究。上市申请阶段，质量研究9283、8一般应至少包含代表性临床样品批次和商业化工艺验证批次。原液和制剂之间若存在质量特性的差异，应分别取样进行分析。对于与化学递送材料/介质结合形成的核酸复合物，应对核酸、复合物组分和完整复合物分别进行研究。通过全面的质量研究确认产品的关键质量属性（Critical.quality.attributes,.CQA）。质量研究一般选择先进、成熟且灵敏度满足分析需求的方法。由于分析方法本身可能存在的局限性，可考虑同时采用原理互补的不同方法进行研究。具体研究项目应根据产品的类型、作用机制和生产工艺确定，常见的质量研究项目包括（但不限于）：鉴别、结构分析、生物学活性、纯度、杂质、含量、转染/感染效率、一般284、理化特性等。1.1 鉴别和结构分析对于病毒载体类产品，可分别从基因组、结构蛋白和完整病毒颗粒等不同水平对载体进行鉴别和结构研究。基因组水平可采用测序、限制性内切酶酶切图谱、PCR.扩增特异性片段等方法对病毒的基因组、目的基因和相关的调控序列进行确认。研究中若观察到碱基或序列的突变，应对突变的原因进行分析，同时结合突变位点对基因功能的影响，以及病毒载体的遗传稳定性特点评估突变对产品安全性和有效性的影响。结构蛋白和病毒颗粒水平，可通过衣壳蛋白的分离鉴定、免疫印迹、病毒颗粒的血清型鉴别、镜下结构、颗粒大小分布、折光度等方法对结构蛋白的表达和病毒颗粒的组装进行确认。对于部分结构复杂或分析方法有限的病毒285、载体，可考虑结合病毒载体的表型、活性，以及病毒载体感染靶细胞后的基因序列分析等，综合进行病毒的鉴别和结构分析。对于核酸类产品，需要对核酸序列的正确性和结构的完整性进行确认。核酸若存在单/双链、线性、环状、超螺旋等多种拓扑异构体，应对各组分进行鉴别和比例分析。部分核酸产品的功能活性可能与核酸的二级或高级结构相关，如局部的发夹结构等，建议对此类结构进行研究。对于.mRNA.等的结构和修饰，如核苷酸修饰、加帽修饰、PolyA.尾等，应分别进行鉴别和确认。对于核酸与化学递送材料/介质结合形成的递送复合物，建议对核酸分子、递送复合物的结构，以及核酸和递送复合物之间的相互作用进行研究。例如，复合物的研究可286、包括如等电点、结构形态、粒径及分布、表面电荷、复合物组分比例、核酸复合/包封率、颗粒聚集、核酸释放、特定环境中的稳定性等，另外，还应对所用的脂质等递送材料/介质进行鉴别和含量研究。对于细菌载体类产品，建议对菌株的染色特性、镜下形态、菌落形态、培养特性等表型和生化特性进行研究，采用测序、PCR、限制性酶切分析等方法对菌株的基因组和/或负载质粒、附加体的序列，尤其是特征序列和工程改造序列进行确认，对质粒大小、拷贝数、质粒丢失率、外源目的基因的突变等进行检测。991.2 生物学活性生物学活性是反映产品质量和临床有效性的重要指标。上市阶段，需建立与产品体内作用机制相同或相关的生物学活性分析方法用于产品287、的功能活性研究。产品若存在多种可能的作用机制，应分别对相应的活性进行研究，根据活性与产品作用机制的相关性，确定一项或多项适宜的活性检测方法作为质量控制项目。不同功能活性之间若存在步骤或功能的相关性/承接性，应尽可能在方法中进行整体体现，如产品的转染/感染活性与产品在细胞内的基因替代、补偿、阻断、修正作用的相关性。对于含有多种活性成分的产品，应分别建立方法对各成分的活性进行研究，同时考虑活性成分之间可能存在的干扰、协同等相互作用。方法学体系应尽量模拟产品的体内作用条件，选择与体内过程相同或相关的细胞类型，分析产品的转染/感染效率、基因表达/抑制水平、表达产物的活性，以及其他与载体或递送系统作用机288、制相关的因素。对于部分具有选择性递送特性的产品，应对产品的组织/细胞的嗜性、感染特异性，或基因表达的选择性进行研究。活性分析方法应考虑建立适当的活性对照品。1.3 纯度、杂质和污染物1.3.1 产品相关杂质产品相关杂质是指生产或储存过程中产生的非预期的、非功能形式的产物。病毒载体类产品潜在的产品相关杂质一般包括非完整包装病毒（如空壳病毒颗粒、非包膜病毒颗粒等）、错误包装病毒颗粒、杂合病毒（Hybrid.virus）颗粒、无活性病毒颗粒、病毒颗粒聚集体、游离病毒基因组等；核酸类产品常见的产品相关杂质如，酶切和重组相关序列、编码错误序列、不完整序列、降解片段、结构异常和错误修饰序列，以及脂质体组合289、过程产生的相关杂质等；细菌载体类产品的产品相关杂质可能为非单克隆性菌株，质粒、改造基因丢失/重排等。为控制产品质量，建议对各类产品相关杂质进行分离和鉴定，评估其安全性风险，根据评估结果考虑杂质残留的控制策略。杂质分析中，可根据目标产物与产品相关杂质在理化特性方面的差异，选择适当的方法对各组分进行分离，必要时可能需要结合多种原理的检测方法对产品的组分进行分离和表征研究。检测结果可以绝对纯度和/或相对纯度的形式表示，如阴离子交换.HPLC.纯度、紫外分光光度法纯度、凝胶电泳纯度、SEC-MALS、病毒载体感染性颗粒的比率等。产品在生产和储存过程中可能会产生多种非预期的变异体，应对检测发现的变异体进290、行鉴别和分析，参考.ICH.Q6B.的理念，根据变异体与目标产物在功能活性、安全性方面的差异，考虑将变异体作为产品相关物质或产品相关杂质进行控制。100对于非复制型或条件复制型病毒载体，应选择最适宜的样品，采用敏感的分析方法检测工艺过程中产生的可复制型或野生型病毒。根据可复制型病毒的种类、残留风险、工艺可控性、临床给药剂量等设定合理的残留标准限度，如腺病毒相关的基因治疗产品，一般建议将可复制型腺病毒（Replication-Competent.Adenovirus，RCA）控制在.1.RCA/31010.VP.（Viral.particals）以内。慢病毒和逆转录病毒等具有较大安全性风险的产品291、，不应检出可复制型病毒。1.3.2 工艺相关杂质工艺相关杂质主要由生产工艺引入，常见如宿主细胞蛋白、宿主细胞.DNA、宿主细胞.RNA、包装质粒、包装用病毒、生产用试剂（如培养基、DNA.模板、工具酶、纯化试剂和填料等），以及设备和耗材如生产管线、包装、容器的浸出物等，应对生产工艺的杂质清除性能和杂质的残留水平进行研究，评估杂质残留的安全性风险，必要时将具有潜在安全性风险的杂质残留纳入产品质量标准进行控制。生产过程中如使用了包装用病毒，应对包装用病毒的残留水平、感染活性、复制能力和/或表达活性进行分析，并评估其残留安全性，根据评估结果制定相应的控制策略。生产若使用了肿瘤细胞系（如.Hela.细292、胞）、致瘤细胞系，或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞（如.HEK.293T.细胞），在确保无完整活细胞残留的同时，需对.DNA.的残留量和残留片段大小进行控制，合理拟定标准限度。如有可能，建议尽量将残留.DNA.控制在.10ng/剂以内，.DNA.残留片段的大小控制在.200bp.以下。对于产品中已知的、具有潜在安全性风险的特定转化序列，如.HEK.293T.细胞携带的.Adv.E1A.序列、SV40.大.T.抗原序列，Hela.细胞携带的.HPV（Human.Papilloma.virus）E6/E7.基因等，应分别进行残留控制。对于 AAV.等易于将非载体.DNA.包装入病毒颗粒的病毒载293、体，在选择包装细胞、辅助病毒和包装质粒时应考虑相关外源.DNA 包装入病毒颗粒的潜在风险。对于新型或复杂递送系统，脂质体等聚合物辅料的制备工艺相关的杂质，以及聚合物降解产生的杂质，也应纳入杂质的考虑范围。1.3.3 污染物污染物一般是指生产过程中引入的微生物或相关组分，如细菌、真菌、支原体、外源性病毒、细菌内毒素等，需对其污染风险进行研究与控制。1011.4 含量病毒载体类产品可通过诸如总颗粒数、基因组拷贝数、结构蛋白含量、感染性滴度或感染性颗粒数等检测确定病毒含量。为了在保证产品疗效的同时能有效控制产品免疫原性风险，病毒载体类产品的规格或剂量建议以相应体积的病毒总颗粒数或基因组拷贝数表示，同294、时通过控制感染性滴度以及感染性颗粒的比率保证活性病毒颗粒的数量。核酸类产品可通过对.DNA/RNA.浓度、拷贝数等检测确定核酸含量，还需对递送系统各组分等特殊辅料含量（如适用）进行研究。细菌载体类产品可以活菌数或菌落数表述含量。含量检测应尽可能使用标准品或对照品予以校准。1.5 其他特性分析其他特性分析可能还包括如外观、澄清度、重要辅料含量、可见异物、不溶性微粒、pH.值、渗透压、装量等。对于整合型的病毒和核酸产品，应对产品的整合位点、整合稳定性和位点分布趋势进行研究，分析插入引起的致突变或致瘤风险。对于非整合型病毒载体，建议对载体的非整合特性进行确认。1.6 基因编辑技术的相关考虑目前，各界295、对.CRISPR-Cas、TALEN、ZFN、Meganuclease 等基于酶的基因编辑技术的风险认知较为有限，且编辑酶在不同细胞内的编辑或剪切效果可能存在一定差异，而当前的研究方法对编辑或剪切效果的分析仍存在一定的局限性。因此，对于基于.CRISPR-Cas、TALEN、ZFN、Meganuclease.等编辑工具而设计的基因治疗产品，建议采用多种方法对编辑系统的风险进行全面的分析和评估。例如，编辑系统自身特定的局限性，序列靶向的特异性，脱靶位点的分析，编辑酶的忠实性（fidelity）和编辑效率，编辑系统的生产和质量控制，编辑技术对细胞促瘤/成瘤的优势筛选，编辑系统组分的免疫原性，编辑工296、具相关序列的非特异性插入，多靶点编辑的基因组重排，基因组突变等。开发过程中，应结合研究进展和方法学的改进完善编辑系统的质控策略。CRISPR-Cas、TALEN、ZFN、Meganuclease.等基于酶的基因编辑工具的脱靶风险和脱靶位点的分析需要结合多方面的信息进行综合判断。由于序列设计规则和算法不同，不同序列设计软件或平台推荐的.sgRNA.等候选靶向结合序列可能会有较大的差异，建议综合对比多个平台的设计和潜在脱靶位点的分析筛选候选序列。脱靶位点分析时，在采用生物信息学工具、序列同源比对、脱靶系统评分工具等多种方法对潜在脱靶位点进行理论筛选的同时，可参考治疗方案进行体外细胞模拟试验，通过核297、型分析、基因组断裂检测、深度测序等方法对潜在的脱靶位点和基因组重排的情况进行分析。模拟试验时，需尽可能模拟编辑系统在体内发挥作用的温度、离子浓度、pH.值等条件，考虑.sgRNA.等靶向结合序列102的异质性序列、编辑酶的异构体、编辑系统各组分的浓度等最差条件下的脱靶情况。对检测到的脱靶位点，可根据位点位置、基因功能等进行风险分析，必要时可结合动物或人体试验数据综合判断。2.质量标准质量标准作为产品质量控制的重要组成部分，是基于产品质量研究确定的用于控制产品质量的标准，一般由检验项目、分析方法和标准限度组成。质量标准一般包括原液（如有）、半成品（如有）和制剂的质量标准。由于工艺的差异，部分产品298、可能无明确的原液生产阶段，标准中应对原液、半成品和制剂阶段进行明确的定义。质量标准中的部分项目如无法在制剂或原液中进行检测，或采用其他中间阶段的样品进行检测更有利于对产品质量进行控制时，可以考虑通过检测适当的中间产物对产品的质量进行控制。2.1 检验项目质量标准中的检验项目通常是根据质量研究确定的，对产品安全性和有效性有重要影响的质量属性，一般包括鉴别、一般检项、理化特性、纯度、杂质、含量、生物学活性、外源因子等，具体检验项目应基于产品类型、生产工艺、质量研究、稳定性和风险评估等确定。脂质体、纳米颗粒等特殊剂型应根据具体特点选择适当的质量控制项目，如颗粒大小和分布、折光率、包封率、表面电荷等。299、对于非复制型或条件复制型病毒载体，需对复制型或野生型病毒进行控制。制剂若采用特殊容器或药械组合装置，还需要根据装置的功能增加特定的检项。其他检验项目可参考中国药典“人用基因治疗制品总论”的要求，部分检项可不在原液和制剂中重复检测，但应考虑制剂工艺对相应质量属性的影响。对于研究认为重要且未纳入质量标准的检验项目，应有充分的理由或验证研究数据的支持。2.2 标准限度质量标准中，各检验项目标准限度（可接受标准）的制定应有合理的依据，一般需考虑目标产品质量概况（QTPP）、临床试验暴露情况、产品质量属性特征、批次放行检测结果以及稳定性研究等。标准限度制定过程中，根据代表性工艺批次数据分析确定工艺对产品300、质量的控制能力时，还需综合考虑产品的稳定性变化趋势，非临床和临床研究中样品批次在研究对象中的质量暴露情况，商业化规模生产产品质量应与关键性临床研究所用样品一致，标准限度要求一般不应低于临床研究中受试者的最差暴露情况。2.3 分析方法为实现对产品质量的有效控制，检测应选用先进、成熟，并经过适用性优化的分析方法，103鼓励选用多种原理互补的分析方法用于质量控制。方法学验证一般应于上市申请前完成，但基于不同研发阶段产品质量控制和对比研究的需要，建议尽量在确证性临床试验开展前完成方法学的开发和验证，部分安全性和含量检测相关的质量控制方法需在临床试验开展前进行必要的方法学确认研究。研发期间若发生了方法学301、变更，应对变更前后的方法进行桥接研究。对于有效期短或样本量少的产品，可考虑选用快速、微量的新型检测方法作为药典方法的替代方法，但应证明该方法相比药典方法具有等效性或优越性。2.4 对照品/标准品在缺少国家标准品和国际标准品的情况下，基于方法分析需要，可按照标准品的制备要求自行制备相应的活性标准品或理化对照品，并对其进行相应的质量研究和放行检测。不同研发阶段，可基于质控需要选用相应阶段代表性工艺生产的样品制备标准品/对照品，但应做好不同阶段标准品的桥接研究。对照品/标准品的建立和制备应符合 中国药典“生物制品国家标准物质制备和标定”的一般要求，根据用途对其进行标定并开展必要的贮存稳定性研究。为做302、好对照品/标准品的溯源性，一般建议对对照品/标准品进行分级管理。九、稳定性研究稳定性研究可参照生物制品稳定性研究技术指导原则（试行）和.ICH.Q5C.的相关要求进行。研究方案应根据产品自身的特点、临床用药方案等情况设定，研究项目一般包括长期稳定性、加速稳定性、影响因素研究、运输稳定性、使用稳定性等，研究条件应根据具体的贮存、运输和使用情况，以及相应条件下的研究目的确定。研究考察的项目应全面、合理，尤其是对产品的稳定性变化趋势、安全性、有效性有重要指示意义的项目，检测方法应经过验证并能灵敏检测出产品的稳定性变化特征。研究时应选用代表性工艺生产的产品或中间样品，放置在产品/样品实际储存容器，或与303、实际储存容器材质相同，且能代表最差暴露条件的其他规格的容器中进行。产品/样品的有效期应根据稳定性研究结果设定，研究期限通常应覆盖产品/样品的实际贮存或使用时限。病毒载体类产品由于稳定性较差，一般采用低温贮存，研究过程中需密切关注病毒载体在贮存、运输和使用过程中的滴度（尤其是感染滴度）、聚集体和生物学活性的变化，限制病毒载体的冻融次数，避免暴露于易使病毒载体失活、降解或聚集的影响条件。DNA.类核酸的稳定性相对较好，但剧烈的环境条件和核酸酶暴露仍有可能对.DNA.的高级结构、完整性产生破坏。RNA.类核酸稳定性较差，且对.RNA.酶（Ribonuclease，RNase）较为敏感，其生产和贮存应304、处于严格的无.RNA.酶的环境。经与化学递送材料/介质结合形成的核酸递送复合物，需关注核酸及复合物的理化特性和生物学活性的变化，如104包封率、含量、纯度、粒径及分布、表面电位、颗粒完整性，以及颗粒的聚合、聚集、包封药物的泄露等。另外，需关注核酸递送复合物中脂质体等化学递送材料/介质成分的稳定性。细菌载体类产品在适当的冻存液和冻存温度下贮存一般较为稳定，需关注研究条件下细菌载体的活率、转基因的稳定性和生物学特性的变化。除上述特征外，其他可能在贮存、运输和使用过程中发生变化的理化特性（如.pH.值、渗透压、浓度、不溶性微粒等）、关键成分和微生物污染情况等也应在研究过程中进行适当的考察。十、包装及305、密封容器系统包装及容器密封系统一般包括原液（如有）、半成品（如有）、制剂，以及配备的稀释剂的包装容器。容器和密封系统的选择应具有合理的依据，能充分保障样品或产品的贮存稳定性。为避免储存容器或密封系统对产品的质量产生非预期影响，应对容器和密封系统进行相容性研究和密封性研究。研究条件的设定应考虑容器和密封系统在特殊条件下的相容性和密封性，如冷冻条件下的密封性能，加速条件下的相容性等。对于病毒载体等具有生物活性的活性成分，需要关注贮存和使用过程中，浸出物对其活性的影响。对于具有特殊功能的次级包装材料（如遮光材料），应对其相应功能进行研究和验证。涉及特殊给药装置的产品，如电穿孔装置、鼻喷装置、无针注射306、器等，需考虑相关医疗器械的研发要求，以及给药设备与产品的相容性。十一、名词解释起始原材料：用于生成产品活性成分，或为产品活性成分提供组分的原材料，如病毒载体生产用的病毒种子批、转染质粒、生产/包装细胞库，非病毒载体生产用的质粒、宿主菌、细菌种子批等。杂合病毒：是指生产过程中产生的，混入外来其他病毒基因的病毒。病毒载体感染性颗粒比率：是指病毒载体感染活性滴度与载体颗粒数的比值。对照细胞：是指病毒生产中，按一定比例留取生产/包装细胞，不进行质粒转染或接种目标病毒，与转染质粒或接种目标病毒的其他细胞采用相同的培养基成分，并在同一培养温度和培养场地下，平行培养至规定的时间。采用规定的方法，通过对对照细307、胞外源因子检测情况的判定，评估该生产细胞批次的外源因子污染情况。核酸复合物：核酸经与化学递送辅助材料/介质混合后形成的聚合物。105十二、参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020 年版）.2020.2.European.Medicines.Agency.Guideline.on.the.quality,.nonclinical.and.clinical.aspects.of.gene.therapy.medicinal.products.EB/OL.2018.3.European.Medicines.Agency.Guideline.on.quality,.nonclinica308、l.and.clinical.aspects.of.medicinal.products.containing.genetically.modified.cells.EB/OL.2020.4.U.S.FDA.Chemistry,.Manufacturing,.and.Control.(CMC).Information.for.Human.Gene.Therapy.Investigational.New.Drug.Applications.(INDs).Guidance.for.Industry.EB/OL.2020.5.U.S.FDA.Recommendations.for.Microbial309、.Vectors.used.for.Gene.Therapy.EB/OL.2016.6.CDE.人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 EB/OL.2008.106重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则国家药品监督管理局药品审评中心2024 年 01 月107一、前 言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因（或基因编辑工具）导入人体，通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒（recombinant.adeno-associated.virus，rAAV）载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持310、久等结构和生物学方面的优势，已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。为规范和指导以rAAV为载体的体内基因治疗产品（以下简称为“rAAV载体类产品”）按照药品研发规律和相关技术管理规范进行研究，提交符合临床试验申报要求的药学研究资料，根据中华人民共和国药品管理法、药品注册管理办法等相关法律法规制定本指导原则。本指导原则仅基于此类产品现阶段的研发水平和科学认知，从技术审评的角度对此类产品在申报临床试验时应完成的药学研究提出一般性建议。因不同产品在设计和临床应用方面可能存在差异，具体品种的药学研究可采用具体问题具体分析的原则，但应能满足药学技术评价的需求，并符合临床试验用药品质量的要求311、。后续，相关技术要求将随着行业水平的提高、技术的进步，以及产品认知的积累逐步完善。二、适用范围本指导原则中的 rAAV 载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性，经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因（或核酸片段）的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的 rAAV 载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。需要说明的是，对于携带基因编辑工具的 rAAV 载体类产品，由于其作用机制涉及对人体细胞基因组的编辑操作，而当前此类产品的人体研究经验较为有限，因此仍属于风险相对较高的产品，可能需要开展更全面的风险评估和质量控制。随着研究的深入和经验的积累，相关研究在参考本312、指导原则的同时，可能需要适当补充和完善相关的技术要求。三、一般原则临床试验申报阶段，AAV 载体类产品可参考中国药典的相关要求（尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求），结合申报阶段的特点，制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“药品生产质量管理规范（2010.年修订）临床试验108用药品附录”（2022 年第 43 号）的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。按照药品研发的 rAAV 载体类产品应遵循药品研发的一般规律，在临床试验申报时提供必要的药学研究信息，说明和/或证明产品设计的合理性，生产工艺的可重复性，临床试验313、用药品质量的可控性，分析药品风险控制策略的合理性和充分性，最大程度降低药品的安全性风险，以支持临床试验的开展。rAAV 载体类临床试验用药品可参考体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）中的一般原则进行风险分析和控制。在临床试验申报阶段一般应完成临床试验用药品生产相关的种子批、细胞库的制备和检定，并开展必要的稳定性研究，以支持临床试验用药品生产所需的传代代次。基于产品特点，完成临床试验用药品生产工艺的开发和初步确认，并建立必要的生产过程中控制项目。选择代表性样品开展质量研究，并基于对产品质量属性的理解和前期的数据积累建立临床试验用药品的质量标准。质量控制相关分析方法经研究确认，应能满314、足分析和质量控制的需求。基于产品设计和作用机制，初步建立生物学活性分析方法。临床试验用药品的稳定性研究结果应能支持开展临床试验。由于不同产品之间的风险可能不同，不同研发阶段的产品可能存在设计和工艺方面的差异，为支持人体临床试验的安全性，申报临床试验时需提供支持申报的非临床研究样品与拟用于临床试验的药品在生产用物料、生产工艺、质量等方面的对比信息。临床试验用药品的质量不得劣于非临床研究用样品的质量，尤其需要关注与安全性相关的质量属性。四、生产用物料生产用物料是指产品生产过程中所使用的生物或化学材料，包括起始原材料（如生产/包装用细胞、包装用质粒、包装用病毒等）、生产过程使用或添加的物料（如培养基315、及其添加成分、核酸酶、纯化填料、缓冲盐、转染试剂等）、辅料，以及生产用耗材（如细胞培养袋、滤膜、深层滤器、储液袋、传输管路、暂存容器等）等。1.起始原材料不同病毒包装系统包装生产的 rAAV 载体在基因组稳定性、包装效率、外源因子的引入风险等方面可能存在一定差异，建议结合产品特点和风险选择合适的包装系统用于生产。rAAV 载体生产常见的病毒包装系统包括质粒瞬时转染（瞬转）包装系统、辅助病毒包装系统、昆虫细胞/杆状病毒包装系统等，涉及的起始原材料可能包括包装用质粒、生产/包装用细胞、包装用病毒等。产品在设计和上游构建方面，可参考体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）中“五、产品设计的316、一般考虑”和“六、生产用物109料”章节的相关要求。用于临床试验用药品生产的起始原材料来源应清晰，具有完整的溯源性信息。申报时，根据包装系统提供相应的上游构建信息，以及相关的证明性文件和研究报告，信息应准确、完整。基于包装系统的类型，药品生产如涉及包装用质粒、包装用病毒等起始原材料的制备，也应提供相应的药学研究信息，具体可参考同类型生物制品原液的申报资料要求。（1）目的基因：详细说明目的基因的序列和来源信息，与野生型序列的差异，提供序列设计（如基因筛选、改造和优化等）合理性和科学性的依据。（2）质粒 DNA：提供质粒构建的具体信息，包括原始质粒的来源、质粒结构图、重要基因或元件的序列来源及功能317、信息，详述质粒构建过程并对最终质粒序列进行确认。提供相关的来源证明和检定报告。瞬转生产 rAAV 的包装用质粒的生产应基于细菌种子批系统，采用适宜的方法纯化，并基于风险分析和产品特性对每批质粒进行质量检测，检测结果符合要求后方能用于载体生产。（3）细菌种子批：瞬转生产用质粒的生产用菌种需进行建库管理，申报时需提供宿主菌的来源、基因型等信息和证明文件，详述细菌种子和种子批的建立过程。按照中国药典要求进行种子批的检定，并提供相应的检定报告。（4）病毒种子批：用于 rAAV 载体类产品生产的包装用病毒应进行建库管理。申报时需提供原始毒种的来源、历史培养信息及相关证明文件，如有改造，需详述病毒种子改造318、和构建的具体过程，结合溯源信息评估病毒种子的安全性风险。病毒种子批的建立和检定应满足中国药典要求，并提供相应的检定报告。（5）生产/包装细胞库：提供 rAAV 载体类产品的生产/包装细胞的来源和证明文件，细胞的历史溯源信息应完整，若存在基因改造，应具体说明改造依据、改造方法和改造结果的确认研究等。细胞的溯源信息和质量控制策略应满足风险控制要求。生产/包装细胞应进行建库管理，建库过程和细胞库检定应符合中国药典要求，并提供相应的检定报告，尤其应关注种属特异性病毒和历史培养、建库过程中可能引入的病原体的检定。细菌/病毒种子批和生产/包装细胞库的传代稳定性研究结果应能支持临床试验用药品的生产。包装用质319、粒、包装用病毒的制备和质量控制可参考体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）中的相关要求，保存稳定性应能满足生产需求。2.其他生产用物料除起始原材料外，需提供所有其他生产使用的原材料和辅料的来源、生物源性组分、质量标准、使用阶段等信息，并提供相关的证明文件。原材料和辅料的质量控制可参照 中国药典通则“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”的相关要求，质控策略应与其风险相符。如有可能，应尽量避免使用动物源或人源性原材料。如需使用，需提供相关的必110要性和合理性说明，并制定相应的风险控制措施。不得使用 内酰胺类抗生素、链霉素，以及其他如溴乙锭等有毒有害试剂，尽量减少或避免使用对环境或人体320、具有潜在不利影响的试剂，如 Triton.X-100 等。临床试验申报时，需提供关键的生产用耗材、仪器和设备的信息。样品直接接触的生产用耗材和设备经评估或研究，应无明显相容性风险，关注样品接触材质对病毒颗粒的吸附和活性的影响。五、生产工艺通过前期的工艺开发和临床试验用药品的制备，应能建立并初步证明生产工艺的合理性和可重复性，拟定工艺应能稳定生产出符合预期质量的临床试验用药品。申报资料须明确临床试验用药品的生产厂和检验厂，提供基本的生产工艺信息，包括生产规模、工艺流程、具体的工艺参数、过程中控制信息、批次定义等。工艺开发信息应能支持临床试验用药品生产工艺设定的合理性，如质粒瞬转工艺中质粒的用量和321、配比、杆状病毒感染工艺中的病毒用量和比例、病毒收获条件、纯化工艺条件、制剂处方筛选等。综合工艺开发研究信息、非临床研究用批次和临床试验用批次的生产情况，初步评估临床试验用药品的生产工艺的合理性和可重复性。由于 rAAV 载体类产品的细胞包装产物中，产品相关杂质种类较多，如空壳病毒等，一般需要通过多个工艺单元进行分离纯化。部分分离纯化方法，如密度梯度离心等，在工艺放大方面可能具有一定局限性，因此，工艺单元的设定还需考虑后续生产规模放大的可能性和可行性。临床试验用药品的生产工艺应设立必要的过程中控制项目。建议在适宜的工艺步骤设立微生物安全性相关的控制项目和与产品关键质量属性相关的中控项目。一般建议322、在病毒收获液阶段常规开展微生物安全性相关的中控检测，项目设定应与产品工艺相匹配，常见如无菌/生物负荷、内毒素、支原体、螺原体（如涉及昆虫细胞或植物源成分）和内/外源病毒因子等检定。外源因子的检测可参考中国药典和 ICH.Q5A 的要求。基于产品内/外源病毒因子的风险评估，必要时，应考虑在工艺步骤中设立病毒清除/灭活工艺单元。一般认为，生产过程中如使用了包装用病毒或存在其他内/外源病毒污染风险时，应考虑在工艺中设立病毒清除/灭活单元以清除/灭活非目标病毒，如去污剂或低 pH 孵育对包膜病毒的灭活，热灭活工艺对温度敏感病毒的灭活，层析和纳滤步骤对病毒的清除等。针对设立的病毒清除/灭活工艺单元，建议323、参考 ICH.Q5A 的一般原则开展病毒清除/灭活验证研究。如有可能，验证研究应尽可能将原材料或工艺步骤中可能引入的病毒或同类病毒纳入指示病毒，如昆虫细胞/杆状病毒包装系统中的杆状病毒和潜在的弹状病毒等。有效的病毒清除/灭活工艺单元病毒滴度下降因子应能达到 4log10 的病111毒清除/灭活效果。基于风险评估，必要时，建议考虑设立多种不同原理的病毒清除/灭活工艺单元。基于病毒收获液中非目标病毒的载量检测数据，根据验证研究结果，评估非目标病毒残留的安全性风险。六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV 载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定，一般包括（但不限于）：鉴324、别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性，如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整，包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等，分析方法应能满足预期用途。产品的结构和理化特性研究一般包括全基因组的序列分析，单链/自身互补型双链组成情况（如适用），衣壳蛋白亚基的分子量、氨基酸序列和翻译后修饰研究，病毒颗粒的衣壳蛋白亚基比例、热稳定性（温度变化条件下的病毒颗粒结构表征）、颗粒形态和粒径分析等。由于生产过程中 rAAV.载体类产品可能出现基因组不完整或序列突变的情况，建议对病毒基因组完整325、性进行研究。rAAV 载体类产品的含量、纯度和活性分析一般包括载体含量（如病毒颗粒数、基因组滴度、感染滴度等）、衣壳蛋白亚基的纯度、病毒颗粒纯度、比滴度、生物学活性等。由于 rAAV 载体类产品具有较高的异质性，纯度研究需尽量对各类产品相关杂质进行分析，如空壳病毒、部分包装病毒、游离衣壳蛋白、游离核酸、DNA 错误包装、病毒聚集体、可复制型 AAV 等。基于产品作用机制的设计，建议初步建立相关的生物学活性分析方法，如对外源目的基因表达产物正确性的确认，目的基因的表达水平、表达产物的生物学活性等研究。由于作用机制的差异，除基因编辑类产品外，对于开发难度较大的表达产物的生物学活性分析方法，可考虑在326、临床试验期间逐步建立并完善，但建议在其他研究水平进行质量控制（如表达量等），必要时可与监管机构进行沟通。结合工艺，对引入的各类工艺相关杂质的残留水平进行分析或检测，并评估其安全性风险。例如，S/D灭活试剂，亲和配基，宿主细胞蛋白，宿主细胞DNA，生产用质粒（如有），核酸酶，E1A/E1B 基因（如有），有安全性风险的转染试剂，裂解试剂，氯化铯或碘克沙醇等沉降剂（如有），非目标病毒残留（如包装用病毒及其相关杂质等），残留 DNA 片段大小分布等。对生产中可能引入的污染物如细菌、真菌、支原体、内/外源病毒、细菌内毒素等进行检测，或结合过程控制进行风险分析。其他一般特性分析可能还包括外观、装量、pH327、 值、渗透压、可见异物、关键辅料含量、不溶性微粒等。1122.质量标准临床试验用药品的质量标准应根据产品特点、生产工艺、质量研究，以及前期对产品认知的积累等综合评估后拟定。rAAV 载体类产品的质量标准常见包括一般检查（如外观、可见异物、不溶性微粒、渗透压、pH 值、装量等）、鉴别（如基因组相关的鉴别、衣壳蛋白亚基相关的鉴别等）、含量（如病毒颗粒数、基因组滴度、感染滴度等）、比滴度、生物学活性、纯度、产品和工艺相关杂质、可复制型 AAV、污染物、关键辅料含量等。考虑到病毒包装用细胞的差异，建议持续收集包装用细胞的 DNA 残留水平和片段大小分布数据，结合病毒包装用细胞的风险评估，针对 DNA 328、残留水平、片段大小、特定转化因子（如 E1A/E1B 等），及其他特定风险序列等建立合理的质控策略。由于 rAAV 载体类产品的包装产物类型较多，拟定的质量标准应能有效控制各类组分的含量，如病毒颗粒总量，有活性的病毒载体含量，空壳病毒颗粒的残留等。一般建议参考非临床毒理研究批次样品的质量初步拟定临床试验用药品的标准限度，特别应关注与安全性相关的项目，保障临床试验用药品的安全性。3.分析方法申报临床试验时，需提供质量控制相关的分析方法信息，包括方法学原理、分析仪器、试剂耗材、主要操作步骤、数据处理、结果分析和结果判断等。对质量控制相关的分析方法进行确认研究。由于部分产品相关杂质，如空壳病毒、部分329、包装病毒等理化特性与目标产物较为接近，分离和定量分析相对困难，建议选择分离度好、性能稳定的分析方法用于质量控制。可复制型 AAV 作为 rAAV 载体类产品中与安全性相关的重要控制项目，应建立敏感、适用的分析方法。分析方法中靶细胞的传代方式、培养条件，以及辅助病毒的类型和用量应有利于可复制型 AAV 的复制和检出，检测靶点的选择需充分考虑可复制型AAV 产生的方式和类型。鉴于不同衣壳类型的 AAV 对细胞的感染特性可能存在差异，方法建立需关注检定用细胞、辅助病毒、对照设立的适用性。一般认为，相同血清型或衣壳类型的阳性对照病毒可能在感染特性方面更具有代表性。根据检测需要，建立质控分析用标准品/对330、照品。标准品/对照品的建立、制备和保管可参照中国药典“生物制品国家标准物质制备和标定规程”的相关要求。基于标准品/对照品的特性和使用目的，进行特性分析（如结构、活性、纯度、含量和其他特性等）、标定和稳定性研究，并确保标准品/对照品的可溯源性。113七、稳定性研究参考生物制品稳定性研究技术指导原则（试行）、体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）等指南开展 rAAV 载体类产品的稳定性研究，可能涉及的研究样品包括生产中间品、原液和制剂等，研究条件和包装容器应具有代表性，考察指标应能敏感反应样品的稳定性，常见的考察指标包括如一般理化特性、外观、不溶性微粒、含量（如病毒颗粒数、基因组滴度、331、感染滴度等）、比滴度、纯度、生物学活性、污染物、关键辅料含量等。研究项目一般包括长期稳定性、加速稳定性、影响因素研究等，建议重点关注冻融、高温等病毒敏感条件对样品的影响。对于产量较少的产品（尤其是罕见病用药），基于质量属性在稳定性方面的变化特征，对于稳定性研究过程中一定期限内可能无显著变化趋势的质量属性检项，经充分评估后，可考虑在该期限内适当减少检测取样点，或检测其他具有相关性的质量属性，如除初期和末期需进行无菌检查外，部分检测点可采用容器的密闭完整性检测作为无菌的支持性检测等。根据临床试验用药品生产和使用可能涉及的运输，结合稳定性研究，开展运输风险评估，必要时应开展运输稳定性研究。参考临床试332、验方案，开展临床使用稳定性研究。不同适应症设计的 rAAV 载体类产品的临床给药方式可能较为多样，部分给药器械可能会对rAAV 载体类产品产生明显的吸附作用或活性影响，导致产品滴度下降。建议关注 rAAV载体类产品与拟定使用的给药器械之间的相容性，并通过模拟临床给药流程，考察给药剂量的准确性和产品的安全性，评估产品的滴度、纯度、生物学活性、不溶性微粒、微生物相关安全性等是否会受给药器械和给药流程的影响。产品的稳定性研究应能支持临床试验的开展。八、包装与密封容器系统提供与样品接触的包装材料的选择依据和相关信息，包括供应商、包材组成、包装材质、质量标准、供应商提供的相容性研究等。开展相关的研究或评333、估，初步分析说明包材的适用性、密封性和相容性符合临床试验用药品的使用要求。部分产品内包材，如环烯烃聚合物（cyclicolefinpolymer）类包材等，可能具有一定的透气性，建议关注储存期间二氧化碳等气体的渗透风险，充分评估包装材料的适用性和风险控制策略。114九、名词解释部分包装病毒：是指存在基因组部分缺失或衣壳组装不完整的病毒颗粒。DNA 错误包装：指非目的基因组 DNA（如宿主细胞 DNA、质粒 DNA 等）包装入病毒颗粒的情况。比滴度：通常以总颗粒数或病毒基因组滴度与感染滴度的比值表示，使用时应予以明确。十、参考文献1.国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020 年版）.2020.2NMPA.药品生产质量管理规范（2010 年修订）临床试验用药品附录.2022.3.CDE.体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）EB/OL.2022.4.NMPA.生物制品稳定性研究